DB11-T 2023-2022鱼类贝类环境DNA识别技术规范

1、ICS 13.020.01CCS Z 01DB11北京市地方标准DB11/T 20232022鱼类贝类环境 DNA 识别技术规范Technical regulations for fish and shellfish identification using environmental DNA2022-09-29发布2023-01-01实施北京市市场监督管理局发布DB11/T 20232022目 次前言II1范引文件1语定义1类类eDNA别2剂器具2样4样5DNA取纯化5PCR6序结分析7量证质控制8附录A 资性） 8基条码考9参考10IDB11/T 20232022前 言本文件按照GB/T

2、1.12020标准化工作导则第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由北京市水务局提出并归口。本文件由北京市水务局组织实施。晨旺。IIDB11/T 20232022鱼类贝类环境 DNA 识别技术规范范围本文件规定了鱼类贝类环境DNA（eDNA）识别的对象、技术方法、采集和实验分析等技术要求。本文件适用于河流、湖泊、水库和渠道等地表水域的鱼类和贝类eDNA识别。件。GB/T 6682 SL 219 水环境监测规范下列术语和定义适用于本文件。3.1鱼 类 fish以鳃呼吸、凭上下颌摄食并通过尾和躯干摆动以及鳍的协调作用游泳的水生脊椎动物，是软骨鱼纲和硬骨鱼纲动物的统称。3.2贝 类

3、shellfish具三胚层、真体腔的软体动物，为底栖动物中的重要功能类群，主要包括双壳类（如蚌类、贻贝） 和腹足类（如螺类）。3.3DNA environmental DNA (eDNA)从生物生活环境中直接提取到的不同物种DNA的总和，包含动植物脱落的细胞或游离的DNA，可提供一个环境中生活物种的存在记录。3.4聚合酶链式反应 polymerase chain reaction (PCR)一种用于扩增特定DNA片段的分子生物学技术，包括变性、退火、延伸等主要步骤。1DB11/T 202320223.5分类操作单元 operational taxonomic unit (OTU)97%的OTU

4、3.6引物条形码 barcode为高通量测序时区分不同样点来源的物种基因序列，在扩增引物5端增加的序列特异性短片段标记。eDNA鱼类贝类eDNA识别程序见图1。图1 鱼类贝类 eDNA 识别程序试剂除非另有说明，试剂均使用符合国家标准的分析纯试剂，试验用水均使用满足GB/T 6682中一级水要求的新制备的超纯水。具体要求如下：次氯酸钠：化学纯；消毒液：次氯酸钠和蒸馏水配制，有效氯浓度 5.5%6.5%（质量分数）；2DB11/T 20232022无水乙醇：化学纯，分析纯；75%3:1 75%70%乙醇：无水乙醇和超纯水 7:3 配制；乙二胺四乙酸（EDTA）；氢氧化钠（NaOH）；EDTA 5

5、.8448 g EDTA pH 8.01000 mL，12118 minEDTA （EDTA）=0.5 mol/L14.612 g EDTA NaOH pH 8.0100 mL，12118 min三羟甲基氨基甲烷盐酸盐（Tris-HCl）；浓盐酸；Tris-HCl 溶液，（Tris-HCl）=0.1 mol/L：称取 15.76 g Tris-HCl 溶于适量超纯水中，浓盐酸调节 pH 至 8.0，定容至 1000 mL，121灭菌 18 min，冷却后常温保存；十六烷基三甲基溴化铵（CTAB）；氯化钠（NaCl）；CB 4 g CB 和6.38 g NaC002 o/L ED8mL 0.1

6、mol/L Tris-HCl 20 200 mL，12118 min蛋白酶 K：酶活力单位为 20；Tris 饱和酚，pH7.8；氯仿；异戊醇；酚氯仿：Tris 饱和酚、氯仿和异戊醇按 25:24:1 体积比配制；乙酸铵（CH3COONH4）；乙酸铵溶液，（CH3COONH4）=7.5 mol/L：称取 5.78 g 乙酸铵溶于 10 mL 超纯水中；乙酸钠（CH3COONa3H2O）；（CH3COONa）=3 mol/L102.06 g pH 5.225012118 min；DNA DNA DNA DNA DNA OD260/280 1.82.0 OD260/230 2.0；PCR DNA

7、DNA DNA DNA OD260/280 1.82.0 OD260/230 2.0；PCR 聚合酶：碱基错配率低于 10-6；脱氧核糖核苷三磷酸：脱氧腺苷三磷酸、脱氧鸟嘌呤三磷酸、脱氧胸苷三磷酸、脱氧胞苷三磷酸的等摩尔数混合物（各 2.510-3 mol/L），纯度 98%；三羟甲基氨基甲烷（Tris）；硼酸；Tris-硼酸电泳缓冲液（TBE，5）：称取 54 g Tris 和 27.5 g 硼酸溶于适量超纯水中，加入 0.5mol/L EDTA 溶液 20 mL，定容至 1000 mL，121灭菌 18 min，冷却后常温保存；琼脂糖：电泳级；溴化乙锭（EB）；3DB11/T 202320

8、222.0%5TBE 20 180 mL 4 g 50600.1 mg DNA 分子量标准品：范围 0100 bp。具体要求如下：车载冰箱：温控 4及以下；采样瓶：1 L，塑料或玻璃材质，具螺旋帽或磨口塞，使用前 121灭菌 18 min；微量移液器：0.2 L 2 L、1 L 10 L、20 L 200 L、100 L 1000 L；真空抽滤泵及过滤砂芯；冰箱：温控-20；高压蒸汽灭菌器：可达到标准要求的 121及 18 min 灭菌条件；混合纤维素酯滤膜：孔径 0.45 m；手术剪；尖头镊子；离心管：1.5 mL，无 DNA 酶；PCR 管：200 L；1 230 nm260 nm 280

9、 nm，检出限 2 ng/L (dsDNA)；PCR 仪：温控范围 0100，升温速度 6/s，配套 PCR 管 200 L；低温离心机：最高离心转速不低于 13000 rpm，温控范围低至 4；凝胶成像分析系统：302 nm 光源；eDNA采样点的布设应遵循以下原则：2 km2 115km220 km2 1SL 219 eDNA 500 m eDNA 50 m 2 50 m 3 eDNA 5 meDNA 0.5 m 1 L m 1 L 水样。4DB11/T 20232022eDNA 10 m0.5 m10 m0.5 m 1 m eDNA 0.5 m 1 L430 洗 10 min，烘干备用。

10、1.5 mL12118 min0.45 m抽滤漏斗。1 L 1.5 mL 424 h-207 DNADNADNA具体要求如下：1 mm23 1.5 mL750 L CTAB20 LK56浴裂解 3 h，期间每隔 0.5 h 进行间断性震荡；Tris 4、13000 rpm 离心 10 min；13000 rpm10 min；250 L 7.5 mol/L的乙酸铵溶液，混匀，-20放置 30 min；4、13000rpm10 min1 mL75%乙醇，4、13000 rpm5 5DB11/T 20232022g50 LDNA DNA 2.0%DNA 完整性；DNA 1.82.0 也可采用符合5.

11、1中要求的动物组织细胞DNA提取试剂盒完成，具体操作步骤可参考试剂盒要求。DNA具体要求如下：8.1 1/103 mol/L2.54、4000 rpm 30 min100L70%乙醇，4、3000 rpm15 minda 1/2 DNA 也可采用符合5.1中要求的柱式PCR产物纯化试剂盒完成，具体操作步骤可参考试剂盒要求。PCR选择鱼类线粒体特定通用扩增引物对eDNA进行扩增。引物核苷酸序列如下：上游引物F：GTCGGTAAAACTCGTGCCAGC下游引物R：CATAGTGGGGTATCTAATCCCAGTTTG选择贝类线粒体特定通用扩增引物对eDNA进行扩增。引物核苷酸序列如下：上游引物F

12、：GGWACWGGWTGAACWGTWTAYCCYCC 下游引物R：TANACYTCNGGRTGNCCRAARAAYCA在合成引物前，应根据样点数量在扩增引物5端添加相应数量的引物条形码，以区分不同样点物种的扩增产物。条形码一般为4碱基、6碱基和8碱基。可参考附录A中列出的8碱基条形码参考序列进行添加，也可根据情况自行设计添加。不影响扩增结果且测序后可区分不同样点的引物条形码均可使用。PCR使用9.1中引物对提取的鱼类和贝类DNA进行PCR扩增。PCR扩增体系包括PCR聚合酶、聚合酶缓冲液、脱氧核糖核苷三磷酸、上下游引物、经8.1和8.2提DNA25 PCRPCR仪反应程序设置：预变性：94

13、5 min；扩增：每个循环包括 94变性 30 s、52退火 30 s、72延伸 90 s，重复 25 个循环；6DB11/T 20232022延伸：72 10 min。4PCR8.22.0%PCR8.1。对PCR引物条形码的读长，以及错配或测序错误生成的序列；3545%0.5105bp20bp；20 bp；PCR 5 bp10 bp fasta OTUs具体要求如下：经筛选与处理的测序数据需使用相关生物信息学分析软件基于 97%OTUsBLASTnNCBIDDBJEBIMitoFish 不少于 10 次，筛选出匹配的序列信息；E （eDNA 10-80、相似度和覆盖度均大于 85%的 OTU

14、s；应按表1所列内容记录数据处理结果。表1 鱼类/贝类 eDNA 识别结果记录表序号物种编号学名分类信息E 值序列相似度(%)序列覆盖度(%)界门纲目科属种1.7DB11/T 20232022具体要求如下：13424 h -20和污染。具体要求如下：1DNA PCR具体要求如下：DNA设置PCR DNA DNA PCR 3 2 1 PCR 8DB11/T 20232022附 录 A（资料性）8 碱基条形码参考序列作为PCR引物标记的8碱基条形码参考序列见表A.1。表A.1 8序号序列序号序列序号序列序号序列1ACACCACA13CATGGATC25GACAGAGT37TATTCCGC2ACCTAGCA14CCATCGTT26GACTGTGT38TCAGTCAG3ACGACTAC15CCTACCAT27GAGAGTGT39TCCTCTAG4AGACGTCT16CGAACGAA28GATCCAAC40TCGACAAC5AGTCACTG17CGTAATCG29GCATAAGG41TCTGCTGT6ATCCGGAT18CGTTGCTT30GCTACGTA42TGCAGTAC7ATGCTTCC19CTACGATG31GGATTACC43TGCTGATG8ATTAGCCG20CTAGCTAG32GTACGAAG44TGTCACTC9CAACCTAG21CTCAAGTG