SDS-PAGE测定蛋白质的相对分子质量ppt-Powe

1、SDS电泳测定蛋白质相对分子质量实验目的的了解SDS垂直板板型电泳泳法的基基本原理理及操作作技术。学习并掌掌握SDSPAGE法测定定蛋白质质相对分分子量的的技术。实验原理理SDS-电泳泳法，即即十二烷烷基硫酸酸钠聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶电泳法法，。1在蛋蛋白质混混合样品品中各蛋蛋白质组组分的迁迁移率主主要取决决于分子子大小和和形状以以及所带带电荷多多少。2在聚聚丙烯酰酰胺凝胶胶系统中中，加入入一定量量的十二二烷基硫硫酸钠（SDS），SDS是是一种阴阴离子表表面活性性剂，加加入到电电泳系统统中能使使蛋白质质的氢键键和疏水水键打开开，并结结合到蛋蛋白质分分子上（在一定定条件下下，大多多数蛋白白质与SD

2、S的的结合比比为1.4gSDS/1g蛋蛋白质），使各各种蛋白白质SDS复复合物都都带上相相同密度度的负电电荷，其其数量远远远超过过了蛋白白质分子子原有的的电荷量量，从而而掩盖了了不同种种类蛋白白质间原原有的电电荷差别别。此时时，蛋白白质分子子的电泳泳迁移率率主要取取决于它它的分子子量大小小，而其其它因素素对电泳泳迁移率率的影响响几乎可可以忽略略不计。3.当当蛋白质质的分子子量之间时，电泳迁迁移率与与分子量量的对数数值呈直直线关系系，符合合下列方方程：1gMr =KbmR式中：Mr为蛋蛋白质的的分子量量；K为常数；b为斜率；mR为相对迁迁移率。在条件件一定时时，b和和K

3、均为为常数。若将已知知分子量量的标准准蛋白质质的迁移移率对分分子量的的对数作作图，可可获得一一条标准准曲线。未知蛋蛋白质在在相同条条件下进进行电泳泳，根据据它的电电泳迁移移率即可可在标准准曲线上上求得分分子量。仪器、原原料和试试剂仪器：垂垂直板型型电泳槽槽；直流流稳压电电源；50或100l微量量注射器器、玻璃璃板、水水浴锅，染色槽槽；烧杯杯；吸量量管；常常头滴管管等。原料：低低分子量量标准蛋蛋白质按按照每种种蛋白0.51mgml-1样样品溶解解液配制制。可配配制成单单一蛋白白质标准准液，也也可配成成混合蛋蛋白质标标准液。试剂：（1）分分离胶缓缓冲液（Tris-HCl缓缓冲液PH8.9）:取1m

4、ol/L盐盐酸48mL，Tris36.3g,用用无离子子水溶解解后定容容至100mL。（2）浓浓缩胶缓缓冲液（Tris-HCl缓缓冲液PH6.7）:取1mol/L盐盐酸48mL, Tris5.98g,用无离离子水溶溶解后定定容至100mL。（3）30%分分离胶贮贮液：配配制方法法与连续续体系相相同，称称丙烯酰酰胺（Acr） 30g及N，N-甲叉叉双丙烯烯酰胺（Bis）0.8g，溶于重重蒸水中中，最后后定容至至100ml，过滤后后置棕色色试剂瓶瓶中，4保存存。（4）10%浓浓缩胶贮贮液：称称Acr 10g及Bis0.5g，溶溶于重蒸蒸水中，最后定定容至100mL，过过滤后置置棕色试试剂瓶中中，4

5、贮存。（5）10%SDS溶溶液：SDS在在低温易易析出结结晶，用用前微热热，使其其完全溶溶解。（6）1%TEMED；（7）10%过过硫酸铵铵（AP）：现现用现配配。（8）电电泳缓冲冲液（Tris-甘氨氨酸缓冲冲液PH8.3）:称称取Tris6.0g,甘甘氨酸酸28.8g, SDS1.0g,用用无离子子水溶解解后定容容至1L。（9）样样品溶解解液：取取SDS 100mg，巯基基乙醇0.1mL，甘甘油1mL，溴溴酚蓝2mg，0.2mol/L，pH7.2磷磷酸缓冲冲液0.5mL，加重重蒸水至至10mL（遇遇液体样样品浓度度增加一一倍配制制）。用用来溶解解标准蛋蛋白质及及待测固固体。（10）染色液液：

6、0.25g考马斯斯亮蓝G-250，加加入454mL 50%甲醇醇溶液和和46mL冰乙乙酸即可可。（11）脱色液液：75mL冰冰乙酸，875mL重重蒸水与与50mL甲醇醇混匀。实验步骤骤1安安装夹心心式垂直直板电泳泳槽：目目前，夹夹心式垂垂直板电电泳槽有有很多型型号，虽虽然设置置略有不不同，但但主要结结构相同同，且操操作简单单，不易易泄漏。同学们们可根据据具体不不同型号号要求进进行操作作。主要要注意：安装前前，胶条条、玻板板、槽子子都要洁洁净干燥燥；勿用用手接触触灌胶面面的玻璃璃。2配胶胶：根据据所测蛋蛋白质分分子量范范围，选选择适宜宜的分离离胶浓度度。本实实验采用用SDS不不连续系系统，按按下

7、表的的配制分分离胶和和浓缩胶胶。试剂名称配制20ml不同浓度分离胶所需各种试剂用量/ml配制10ml浓缩胶所需试剂用量5%7.5%10%15%3%分离胶贮液（30%Acr-0.8%Bis)3.335.006.6610.00-分离胶缓冲液（pH8.9Tris-HCl）2.502.502.502.50-浓缩胶贮液（10%Acr-0.5%Bis）-3.0浓缩胶缓冲液（pH6.7 Tris-HCl）-1.2510% SDS 0.200.200.200.200.101%TEMED 2.002.002.002.002.00重蒸馏水 11.8710.208.545.204.60混匀后，置真空干燥器中，抽气1

8、0min10%AP0.100.100.100.100.053制备备凝胶板板：（1）分分离胶制制备：按按表配制制20ml10%分分离胶，混匀后后用细长长头滴管管将凝胶胶液加至至长、短短玻璃板板间的缝缝隙内，约8cm高，用1ml注射射器取少少许蒸馏馏水，沿沿长玻璃璃板板壁壁缓慢注注入，约约34mm高高，以进进行水封封。约30min后，凝胶与与水封层层间出现现折射率率不同的的界线，则表示示凝胶完完全聚合合。倾去去水封层层的蒸馏馏水，再再用滤纸纸条吸去去多余水水分。（2）浓浓缩胶的的制备：按表配配制10ml3%浓浓缩胶，混匀后后用细长长头滴管管将浓缩缩胶加到到已聚合合的分离离胶上方方，直至至距离短短玻

9、璃板板上缘约约0.5cm处处，轻轻轻将样品品槽模板板插入浓浓缩胶内内，避免免带入气气泡。约约30min后后凝胶聚聚合，再再放置2030min。待待凝胶凝凝固，小小心拔去去样品槽槽模板，用窄条条滤纸吸吸去样品品凹槽中中多余的的水分，将pH8.3 Tris-甘氨酸酸缓冲液液倒入上上、下贮贮槽中，应没过过短板约约0.5cm以以上，即即可准备备加样。4样品品处理及及加样各标准蛋蛋白及待待测蛋白白都用样样品溶解解液溶解解，使浓浓度为0.51mg/mL，沸水水浴加热热3分钟钟，冷却却至室温温备用。处理好好的样品品液如经经长期存存放，使使用前应应在沸水水浴中加加热1分分钟，以以消除亚亚稳态聚聚合。一般加样样

10、体积为为1015L（即即210g蛋白质质）。如如样品较较稀，可可增加加加样体积积。用微微量注射射器小心心将样品品通过缓缓冲液加加到凝胶胶凹形样样品槽底底部，待待所有凹凹形样品品槽内都都加了样样品，即即可开始始电泳。5电泳泳将直流稳稳压电泳泳仪开关关打开，开始时时将电流流调至10mA。待样样品进入入分离较较时，将将电流调调至2030 mA。当蓝蓝色染料料迁移至至底部时时，将电电流调回回到零，关闭电电源。拔拔掉固定定板，取取出玻璃璃板，用用刀片轻轻轻将一一块玻璃璃撬开移移去，在在胶板一一端切除除一角作作为标记记，将胶胶板移至至大培养养皿中染染色。6染色色及脱色色将染色液液倒入培培养皿中中，染色色1

11、h左右，用蒸馏馏水漂洗洗数次，再用脱脱色液脱脱色，直直到蛋白白区带清清晰，即即用直尺尺分别量量取各条条带与凝凝胶顶端端的距离离。计算1.相对对迁移率率mR=样品品迁移距距离（cm）/染料迁迁移距离离（cm）2.以标标准蛋白白质分子子量的对对数对相相对迁移移率作图图，得到到标准曲曲线，根根据待测测样品相相对迁移移率，从从标准曲曲线上查查出其分分子量。注意事项项1.不不是是所有的的蛋白质质都能用用SDS-凝胶胶电泳法法测定其其分子量量，已发发现有些些蛋白质质用这种种方法测测出的分分子量是是不可靠靠的。包包括：电电荷异常常或构象象异常的的蛋白质质，带有有较大辅辅基的蛋蛋白质（如某些些糖蛋白白）以及及

12、一些结结构蛋白白如胶原原蛋白等等。例如如组蛋白白F1，它本身身带有大大量正电电荷，因因此，尽尽管结合合了正常常比例的的SDS，仍不不能完全全掩盖其其原有正正电荷的的影响，它的分分子量是是21,000，但SDS-凝胶电电泳测定定的结果果却是35,000。因此，最好至至少用两两种方法法来测定定未知样样品的分分子量，互相验验证。2有许许多蛋白白质，是是由亚基基（如血血红蛋白白）或两两条以上上肽链（如-胰凝乳乳蛋白酶酶）组成成的，它它们在SDS和和巯基乙乙醇的作作用下，解离成成亚基或或单条肽肽链。因因此，对对于这一一类蛋白白质，SDS-凝胶电电泳测定定的只是是它们的的亚基或或单条肽肽链的分分子量，而不是是完整分分子的分分子量。为了得得到更全全面的资资料，还还必须用用其它方方法测定定其分子子量及分分子中肽肽链的数数目等，与SDS-凝凝