免疫细胞分离与功能检测课件

1、免疫细胞别离与功能检测免疫细胞别离与功能检测免疫细胞别离与功能检测第一节 免疫细胞的别离22021/1/12第一节 免疫细胞的别离2021/1/122免疫细胞的别离及检测检测：各类免疫细胞及其亚群的数量和功能测定方法：体外法为主目的：判断机体免疫状态意义：讨论疾病的发病机制、开展、预后、疗效免疫细胞的别离 是指将各种参与免疫反响的 细胞从血液或组织中别离出来 2021/1/123 免疫细胞的起源与分化 红细胞 血小板 肥大细胞 中性粒细胞 巨噬细胞 树突状细胞 浆细胞 T细胞 NK细胞2021/1/124免疫细胞种类2021/1/125免疫细胞的别离流程外周血PBMC纯淋巴细胞T、B细胞TC亚

2、群/BC亚群2021/1/126包括：淋巴细胞、单核细胞各种血细胞比重不同,利用密度梯度离心进展别离常用分层液：，一、 外周血单个核细胞的别离和纯化2021/1/127细胞比重血小板1.0301.035PBMC1.0751.090多核白细胞1.092红细胞1.093外周血各细胞成分的密度2021/1/128 别离液法是一种单次差速密度梯度离心的别离法，主要用于别离外周血中的单个核细胞。离心：密度梯度离心别离：各类细胞按其相应密度重新分布一、别离法2021/1/129分层液别离单个核细胞示意图2021/1/1210二、淋巴细胞的别离 纯淋巴细胞群的采集 原理：利用单核细胞在37和离子存在条件下，

3、能主动粘附在玻璃、塑料、尼龙毛、棉花纤维或葡聚糖凝胶的特性，据此建立许多从单个核细胞中除去单核细胞的方法，以获得高纯度的淋巴细胞群。2021/1/1211(一)粘附贴壁法因B细胞也有贴壁现象，因此，本法别离的淋巴细胞群中B细胞有所损失。(二)吸附柱过滤法 将单核 细胞吸附于玻璃柱中，洗脱下来的主要是淋巴细胞2021/1/1212(三)磁铁吸引法利用单核细胞具有吞噬的特性，在悬液中参加羰基铁颗粒，待单核细胞吞噬铁颗粒后，用磁铁将细胞吸至管底，上层液中含较纯的淋巴细胞群。2021/1/12137898四别离法返回章目录2021/1/1214三、T、B细胞和T细胞亚群的别离免疫磁珠别离法流式细胞术别

4、离法 其他方法2021/1/1215一免疫磁珠别离法 2021/1/1216488 激光+-前向散射光检测器 荧光检测器电磁场单个细胞被分类进入检测管流式细胞术别离原理示意图2021/1/1217第二节 淋巴细胞外表标志的检测及亚群分类2021/1/1218一、T细胞外表标志及亚群48348-348+主要为 T 辅助性T细胞主要为 T 细胞毒性T细胞2021/1/1219二、B细胞外表标志及亚群亚群2021/1/1220细胞典型标志：56和16三、 细胞外表标志2021/1/1221第三节 抗原提呈细胞外表标志抗原提呈细胞：是指能摄取、加工、处理抗原，并将抗原信息提呈给抗原特异性淋巴细胞的一类

5、免疫细胞。单核-巨噬细胞树突状细胞2021/1/12221分泌、反响氧中间产物及蛋白水解酶等2效应3激活T细胞产生细胞因子等活化巨噬细胞协同杀伤肿瘤细胞。一单核吞噬细胞141.吞噬和杀伤作用 2021/1/1223形态呈树突样具有一些相对特征性外表标志抗原提呈才能强能激活初始T细胞免疫应答的始动者二、树突状细胞 ，特征：2021/1/1224 由髓样干细胞多数、淋巴干细胞分化。 如：类分子及类分子、B7-1和B7-2、40、1以及粘附分子等。 1、6、12、等。主要标志：1a、11c、832021/1/1225第四节 T细胞功能检测一、T细胞功能检测2021/1/1226淋巴细胞DNA合成分化

6、母细胞刺激物细胞变大细胞浆扩大空泡核仁明显核染色质疏松（一）T淋巴细胞增殖试验2021/1/1227形态学检查法 3掺入法 比色法 淋巴细胞转化的检测方法2021/1/1228形态学检查法2021/1/1229 转化的淋巴细胞未转化的淋巴细胞淋巴母细胞 过渡型细胞大小(直径m)1220121668核大小、染色质增大、疏松增大、疏松不增大、密集核仁清晰、14个有或无无有丝分裂有或无无无胞质、着色增多、嗜碱增多、嗜碱极少、天青色浆内空泡有或无有或无无伪足有或无有或无无未转化和转化淋巴细胞的形态特征2021/1/1230原理：刺激物3756hG1期 S1期 合成 33716h 3测淋巴细胞内放射量计

7、算判断淋巴细胞转化程度外周血TG0期3掺入法2021/1/1231评价：该方法敏感性高、客观性强、重复性好、可自动操作；设备昂贵、放射污染。 刺激指数 ， 试验管均值/对照管均值3掺入法2021/1/1232放射性测定3H-TdR丝裂原（抗原）刺激淋巴细胞转化试验原理示意3摻入法2021/1/1233原理:用刺激剂体外激活淋巴细胞，用蛋白转运抑制如莫能霉素阻止细胞因子分泌到细胞外，细胞内蛋白质转运方式被打乱，引起细胞因子向高尔基体积聚，用流式细胞仪便可测出淋巴细胞内的细胞因子种类，从而确定1/ 2细胞的百分率。淋巴细胞内细胞因子检测二T细胞分泌功能检定2021/1/1234分泌的细胞因子 2

8、2 - - 3 + + - 4 - 5 - 6 - 10 - 和2分泌的细胞因子2021/1/1235原理:靶细胞抗原T细胞观察杀伤活力致敏靶细胞三T细胞介导的细胞毒试验2021/1/1236 试验方法: 同位素法 淋巴细胞+含51 的肿瘤细胞 肿瘤细胞破坏 51 释放 测定射线51特异释放率= 100%三T细胞介导的细胞毒试验2021/1/1237三T细胞介导的细胞毒试验背景无效应细胞效应细胞/靶细胞 1:1效应细胞/靶细胞 5:1效应细胞/靶细胞 20:1细胞溶解2021/1/1238特异性抗原皮肤试验皮肤试验四体内试验2021/1/1239溶血空斑试验酶联免疫斑点试验体内试验二、B细胞功

9、能检测2021/1/1240一溶血空斑试验溶血斑补体抗血清包被绵羊红细胞2021/1/1241二酶联免疫斑点法抗体产生B细胞抗原包被酶联抗抗体凝胶底物显色2021/1/1242刺激体内抗体产生的特异性抗原有白喉类毒素、破伤风类毒素、多价肺炎链球菌等。将适量抗原皮下或肌肉注射免疫，并于免疫前及免疫后1周、2周、3周分别采血，别离血清，测定受检者免疫前后相应抗体的效价，判断受检者体内B细胞的功能。三体内试验2021/1/1243染色计数离心取上清测或测发光强度测值形态法酶释法放射性核素释放法流式细胞术靶细胞溶解常用靶细胞: K562细胞株三、细胞活性检测返回章目录2021/1/1244 大吞噬细胞

10、:即单核-吞噬细胞系统 小吞噬细胞:即中性粒细胞第五节 其他免疫细胞功能检测技术吞噬细胞的种类2021/1/1245特征性标志 14别离技术密度梯度别离法流式细胞仪别离技术免疫磁珠别离法：为目前较常用的方法 黏附法一、吞噬细胞的别离一单核细胞的别离2021/1/1246斑蝥敷贴法别离人巨噬细胞 动物的巨噬细胞直接从腹腔渗出液中获取 二巨噬细胞的别离2021/1/1247聚合物加速沉降法 可从外周血中别离出白细胞血浆(抗凝血) 别离法 可从白细胞中别离出纯化的中性粒细胞三中性粒细胞的别离2021/1/1248密度梯度离心别离中性粒细胞2021/1/1249吞噬细胞的吞噬活动大体分为趋化、吞噬和胞

11、内杀灭作用三个阶段，据此建立相应的检测方法。 一中性粒细胞功能检测技术 二巨噬细胞功能检测技术二、相关功能检测2021/1/1250细胞趋化功能的检测吞噬功能的检测杀菌功能的检测一中性粒细胞功能检测2021/1/1251体内试验法：皮肤窗法体外试验法：滤膜浸透法 琼脂糖平板法 趋化功能检测检测细胞运动功能皮肤窗法 在受检者前臂屈侧中央3范围内，搔刮皮肤后，用盖玻片压紧固定，在第2，5，8，12，24，36小时各取样一次，染色观察中性粒细胞聚集开场时间、聚集程度等。安康正常人一般23h后开场聚集，达50100个，6小时可达1000个以上。 2021/1/1252 原理及技术要点 在一特制的分上下

12、两层的小盒，将趋化因子参加下室，待检细胞参加上室，两室用微孔滤膜分隔，37温育数小时后，上室的中性粒细胞受下室趋化因子的吸引，由滤膜微孔进入滤膜内，取滤膜清洗、固定、枯燥、染色和透明，在高倍镜下观察细胞穿越滤膜的挪动间隔 ，从而判断其趋化功能。滤膜浸透法2021/1/1253原理及技术要点 在琼脂糖凝胶平板的中孔加白细胞悬液，左孔加趋化因子，右孔加对照液，温育48小时后，用显微镜测微器测定中性粒细胞向左孔的挪动间隔 A和向右孔的挪动间隔 B，计算趋化指数。趋化指数= 趋化指数越大，说明中性粒细胞运动功能越强 琼脂糖平板法2021/1/1254显微镜检查法 吞噬指数=一中性粒细胞吞噬功能检测2021/1/1255复原试验 原理：C + 2C 四氮唑基淡黄色甲紫黑色杀菌功能检测2021/1/1256 方法：1.抗凝血 + 硝基蓝四氮唑NBT，37孵育25min。2.推片染色、镜检。正常值：NBT阳性细胞率应95% NBT复原试验2021/1/1257谢谢大家！内容总结免疫细胞别离