LFY类基因在茎端分生组织形成及其活动中的作用

1、北京大学政学者论文集（2001年） LFY类基因在茎端分子组织形成及其活动中的作用PAGE PAGE 407 LFY类基基因在茎茎端分生生组织形形成及其其活动中中的作用用Expreessiion Pattterrn oof LLFY-likke GGenee annd iits Funnctiion iin SShooot AApiccal Merristtem Acttiviity98级生命命科学学学院 细细胞生物物与遗传传学系 刘曼摘 要要 LFYY类基因因在植物物形态建建成过程程中具有有重要作作用，根根据其突突变体的的特征，曾曾一度被被认为是是在花分分生组织织和花序序分生组组织中特特异表

2、达达的“分生组组织特征征决定基基因”，控制制花序分分生组织织向花分分生组织织的转变变。但随随着研究究的深入入，人们们发现其其在营养养分生组组织甚至至胚胎发发生过程程中都有有所表达达。本实实验试图图通过启启动子活活动特点点研究、mRNA水平上原位杂交分析等各种方法，对其功能进行深入地探讨，以期全面地认识该类基因在植物发育中的作用。Abstrractt LLFY-likke ggenees pplayy immporrtannt rrolee inn pllantt deevellopmmentt, wwhenn thhey werre ffirsst iisollateed ffromm muu

3、tannts of Anttirrrhinnum andd Arrabiidoppsiss, ttheyy weere thooughht tto bbe “SSAM-speeciffic-dettermminaatinng-ggenees”, reegullatiing thee trranssitiion froom iinflloreesceencee too flloweer mmeriisteem. Howweveer, furrtheer rreseearcch rreveealeed tthatt LFFY-llikee geeness aactiivitty ccan be f

4、ouund in embbryoogennesiis, shooot apiicess annd aaxilllarry bbudss att diiffeerennt sstagges as welll aas iin fflowwer priimorrdiaal. We chaaraccterrizeed LLFY proomotters aactiivitty aand invvesttigaatedd LFFY mmRNAA exxpreessiion witth WWholle-mmounnt iin ssituu Hyybriidizzatiion, inn orrderr too

5、 maake theeir funnctiion cleeareer. 引言 植物形态态建成有有与动物物形态建建成完全全不同的的特点：其完成成生活周周期所需需的地上上部分基基本器官官类型都都是由茎茎端分生生组织（shoot apical meristem, SAM）的活动而逐步形成的。因此，茎端分生组织在植物形态建成中的重要性是不言而喻的。但长期以来，虽然人们始终在努力，而且近十年来出现了分离得到茎端分生组织活动相关基因等重大的突破1，可目前在茎端分生组织的形成变化及其终结方式等基本问题方面却仍然没有得到合乎逻辑的解释。根据突变体研究的早期结果，人们形成了目前占主导地位的观点，即茎端分生组织在

6、“胚胎发生”过程中形成，随后在“胚后发生”的过程中，被一些“分生组织特征决定基因”控制，逐步由“营养分生组织”改变为“花序分生组织”和“花分生组织”2。但随着研究的深入，人们逐渐发现，一些过去被认为是在“花分生组织”和“花序分生组织”中特异表达的“分生组织特征决定基因”，大部分都不用程度地在“营养分生组织”甚至“胚胎发生”过程中表达3-7。这些现象是现有的假说所无法解释的。显然，这些新的发现对现有的观点提出了不可回避的挑战。只有通过对这些基因表达特征及其功能的深入研究，我们才有可能真正从分子水平上逐步解释茎端分生组织形成、活动及其终结的分子机理并从中逐步揭示茎端分生组织在植物形态建成中所扮演的

7、角色。 LFY类类基因正正是上述述基因中中的一种种。它的的突变导导致植物物表型发发生一系系列的变变化。在在野生型型植物体体中应发发育成花花的部位位，在llfy突突变体中中则发育育出花序序，或是是仅由萼萼片和花花瓣组成成的异常常花。而而且LFFY和AAPETTALAA1或AAPETTALAA2的双双重突变变体会导导致植物物的花完完全丧失失野生型型花所具具有的缩缩短节间间、顶端端有限生生长等特特点。根根据以上上种种现现象，当当LFYY类基因因从金鱼鱼草和拟拟南芥的的有关突突变体中中分离出出来时，被被认为其其在植物物发育中中控制茎茎端分生生组织从从花序分分生组织织转变为为花分生生组织2，88。但但随

8、着该该基因的的同源序序列从其其他植物物中被陆陆续分离离，人们们发现在在烟草、凤凤仙花、豌豌豆、矮矮牵牛、水水稻、松松树等植植物中，LFY类基因的表达并不局限于花分生组织，而是广泛地存在于不同发育阶段的茎端分生组织3-6，9，10。更重要的是，后来的研究表明，即使在拟南芥中，LFY基因实际上在其早期的发育阶段，即在花序分生组织形成之前，已经在茎端分生组织中表达11。同时，转基因实验表明，LFY基因表达量越大，植物开花越早12，13。因此，对该基因的功能又有了一种新的认识，即它不仅决定花序分生组织转变为花分生组织，而且还影响开花的早晚。 白书农教教授等在在进行另另一种拟拟南芥突突变体eemf的的研

9、究中中，曾注注意到LLFY基基因在植植物早期期发育阶阶段表达达中的特特点，并并曾利用用LFYY:GGUS转转基因植植物为材材料，对对其在植植株“营养生生长”阶段的的表达特特点进行行过系统统的研究究白书书农等，未未发表资资料，119988。发发现LFFY基因因的启动动子不仅仅在种子子萌发后后不同阶阶段的茎茎端分生生组织和和幼小的的器官原原基中表表达，而而且在早早期胚胎胎发生过过程中也也有表达达。最为为引人注注目的是是，LFFY基因因启动子子的活动动与由根根外植体体再生植植株过程程中茎端端分生组组织的形形成及其其活动存存在直接接的相关关。据此此白书农农教授等等提出，LFY基因的表达很可能与茎端分生

10、组织的形成及其活动有关，而它表达量的增长水平和开花相关联。 但是，有有研究表表明，以以GUSS等报告告基因所所显示的的启动子子活动模模式可能能并不一一定反映映该启动动子对其其原有基基因表达达的时空空调节模模式。因因为基因因的表达达不单需需要启动动子的活活动，还还和一些些其他因因子，例例如内含含子等有有关。因因此，要要真正了了解LFFY基因因在分生生组织形形成与活活动过程程中的表表达特点点，还应应有对其其转录产产物即mmRNAA进行原原位检测测的证据据。本课题即是是在本实实验室过过去工作作的基础础上，试试图从正正常植株株与组培培过程再再生植株株中LFFY启动动子活动动方式的的检测和和LFYY基因

11、转转录产物物的直接接检测两两个方面面，对LLFY类类基因早早期表达达特点及及其可能能的功能能等关键键问题进进行进一一步地探探讨。本课题研究究中主要要涉及两两种基因因表达的的检测技技术。当当研究LLFY启启动子活活动方式式时，我我们采用用报告基基因的表表达分析析方法。报报告基因因通常编编码一个个在离体体条件下下易于检检测的酶酶，或者者编码可可以在活活体条件件下进行行组织化化学定位位的蛋白白，这样样就可以以提供基基因表达达定量的的和定性性的信息息。guusA基基因是从从大肠杆杆菌（EEschheriichiia ccolii）中分分离出来来的，并并且目前前有一些些基因盒盒可以允允许在ggusAA基

12、因的的附近插插入启动动子区，产产生转录录融合基基因或翻翻译融合合基因。我我们实验验所用的的Plffy:GUSS拟南芥芥和Pllfy:GUUS烟草草、Pnnfl:GUUS烟草草即是在在gussA基因因前插入入LFYY或NFLL基因的的启动子子（Pllfy或或Pnffl），当当Plffy或Pnffl活动动时，带带动guusA表表达，利利用一个个简单的的组织化化学检测测就可以以精确地地分析ggusAA融合基基因的时时空表达达模式。用用5-溴溴-4-氯-33-吲哚哚葡糖苷苷酸（XX-gluuc）作作为底物物可以精精确地进进行GUUS活性性的定位位，这一一反应分分两步进进行：首首先是切切割葡糖糖醛酸部部

13、分，产产生无色色的吲哚哚氧基中中间产物物，随后后吲哚氧氧基中间间产物氧氧化成为为不溶的的蓝色沉沉淀。用用GUSS进行这这类实验验有如下下优点：（1）在在大多数数植物组组织中GGUS活活性的本本底低；（2）反反应产物物不扩散散，在表表达基因因的植物物细胞内内积累；（3）通通过简单单的扩散散或真空空渗入，底底物易被被植物细细胞吸收收。当然然，也存存在一些些缺点：（1）组组织化学学染色后后植物失失去继续续培养的的可能，这这样不能能跟踪检检测同一一株植物物不同时时期的基基因活动动情况；（2）由由于酶和和产物非非常稳定定，因而而不能真真实的反反映出GGUS替替代的那那个蛋白白在稳定定状态下下的丰度度；（

14、33）人们们发现在在GUSS表达水水平很高高的组织织中会发发生无色色反应中中间产物物渗漏的的现象，但但是，这这可以通通过在底底物溶液液中加入入氧化剂剂高铁氰氰化钾或或亚铁氰氰化钾或或者二者者都加（终终浓度为为5mmmol/L），来来使这种种渗漏减减至最少少（Sttompp 19990; Maasarrenhhas和和Hammiltton 19992）；（4）同同所有的的组织化化学方法法一样，其其检测结结果不是是定量的的。而且且，最致致命的缺缺点是，启启动子的的分析不不一定总总能反映映基因的的真实活活动情况况（如前前文所述述），这这是在运运用报告告基因方方法进行行基因表表达特征征分析时时必须注注

15、意的一一个问题题。当检测LFFY基因因的转录录产物时时，我们们用到了了原位杂杂交 （in situ Hybridization, 简称ISH）技术。该技术最早是由Gall和Pardue (1 969)及John等 (1 969)独立发明的。其基本原理是根据核酸分子碱基互补配对的原则 （A-T, C-G）,将有放射性或非放射性标记的外源核酸 (探针：Probe )与染色体上经过变性后的单链DNA互补配对 ,结合成专一的核酸杂交分子 ,再经一定的检测手段 ,将待测核酸在染色体上的位置显示出来。我们采用的的mRNNA水平平的原位位杂交技技术，是是将含有有目的基基因cDDNA的的质粒分分别用限限制性内

16、内切酶从从目的片片断的两两端单切切，使质质粒线性性化。然然后从两两端用不不同的转转录酶按按照A-U, C-GG的互补补配对原原则合成成一段RRNA片片断，其其中UTTP上标标记地高高辛，这这标记上上的RNNA片断断即为探探针。当当目的基基因表达达时，mmRNAA能和反反义探针针特异性性结合，在在底物的的作用下下显色。而而正义探探针为负负对照。由由于 RRNA原原位杂交交技术能能够精确确确定基基因表达达的时空空分布，而而植物基基因的时时空表达达研究是是探讨植植物生长长发育机机制的重重要手段段，所以以在以研研究植物物发育机机制为主主的本实实验室，原原位杂交交成为一一项主要要的并十十分关键键的技术术

17、。 目目前植物物研究中中，原位位杂交得得到了越越来越广广泛的应应用，主主要有 3种方方法 :一是常常规组织织切片RRNA原原位杂交交，广泛泛适用于于各种组组织 ;二是大大量细胞胞的整体体RNAA原位杂杂交 ,已应用用于花粉粉管和藻藻类合子子;三是是微量细细胞的整整体RNNA原位位杂交 ,用于于分离胚胚囊。我我所使用用的整体体原位杂杂交技术术，是一一种较新新的组织织RNAA原位杂杂交方法法。该方方法的实实验材料料是具有有完整形形态结构构的植物物器官或或其组合合，如花花、花序序等。该该技术能能够直接接从整体体结构上上观察到到基因表表达的空空间特征征，具有有易操作作、周期期短等特特点，并并避免了了一

18、般在在切片上上原位杂杂交所需需的三维维重构步步骤。材料和方法法实验材料 植物材料料野生型拟南南芥种子子（Coolummbiaa）Plfy:GUUS转基基因拟南南芥种子子（由DDetllef Weiigell提供）野生型烟草草种子（Nicotiana tabacun var. Wisconsin 38）Plfy:GUUS转基基因烟草草种子（由由本实验验室毕业业博士生生刘复权权构建、提提供） 菌种和质质粒大肠杆菌DDH5质粒：Pnnfl:GFFP (Kaan RR )Plfy:anntiLLFY(Kann R )PDW1224-LLFY (Ammp RR )以上质粒均均由本实实验室已已毕业博博士生

19、刘刘复权构构建，本本实验室室保存。 分子生物物学和生生化试剂剂各种限制性性内切酶酶购自TTaKaaRa 公司，PPCR试试剂购自自鼎国生生物公司司，原位位杂交地地高辛标标记RNNA探针针试剂盒盒及杂交交液（DDIG eassy HHyb）购购自Roochee生物公公司，各各种激素素和抗生生素以及及x-GGlucc购自北北京经科科生物工工程公司司，其他他试剂均均为国产产分析纯纯。 PCR引引物 以GGFP基基因为模模板的PPCR引引物由本本人设计计，上海海生工生生物工程程公司合合成。 5GFFP (21bbp):5-GGTT GAAA GGGT GATT GCCA AACA TACC-3 3GF

20、PP (118bpp):55-GGAA AGGG GCCA GGAT TGTT GTTG-33 1.55 x-Gluuc 染染色液(1mLL) N、N二甲甲基甲酰酰胺 50uL x-GGlucc 0.55mg 1000mM 磷酸缓缓冲液 pH77.0 9980uuL 5mMM 铁氰氰化钾 10uuL 5mMM 亚铁铁氰化钾钾 110uLL Triitonn x-1000 1uuL 1.66 植物物叶绿素素透明液液 乙醇醇：乙酸酸=9：1 1.77 培养养基 1.7.11 拟南南芥、烟烟草组织织培养基基 MS (含3%的蔗糖糖和0.75%的琼脂脂，调ppH=55.8)愈伤组织诱诱导培养养基（CC

21、alllus-Indduciing Meddiumm, CCIM）: B55+0.5mgg/L 2,44-D + 00.055mg/L KKIN (含2%的蔗蔗糖和00.755%的琼琼脂，调调pH=5.55)生芽培养基基（Shhoott-Innduccingg Meediuum, SIMM）: B55+0.15mmg/LL IAAA + 5mmg/LL2ipp (含2%的蔗蔗糖和00.755%的琼琼脂，调调pH=5.55) 1.7.22 细菌菌培养基基 LB培养养基：每每升培养养基含55克酵母母提取物物，100克蛋白白胨，110克氯氯化钠，pH=7.5，固体培养基含1%琼脂 1.8 原原位杂交

22、交所需试试剂 PBBS: 0.113M NaCCl, 0.0007MM Naa2HPOO4 ,00.0003M NaHH2 POO4 , 0.227mMM KCCl, pH 7.44 PBBT: PBSS+0.1% Tweeen 20 固定定液 (FB): PPBT+0.008M EGTTA, 5%多多聚甲醛醛, 110% DMSSO (pH 7.44) NTTE: 5000mM NaCCl, 10mmM TTriss-HCCl (pH77.5), 11mM EDTTA 封阻阻液 (BS): PPBT+ 2% BSSA 渗入入液 (SB): 1100mmM NNaCll, 550mMM Mgg

23、Cl22 , 1000mM Triis-HHCl (pHH9.55), 0.11% TTweeen 220 停止止渗入液液 (SSSB): PPBT+20mmM EEDTAA 主要方法2.1 质质粒载体体构建部部分2.1.11 原质质粒的酶酶切将Plfyy:aantiiLFYY，Pnffl:GFPP用XbaaI和SaccI双切切，得到到Plffy-载载体和GGFP片片断。2.1.22 从凝凝胶中分分离纯化化DNAA片段(1) 切切下含有有DNAA片段的的胶块，转转移到11.5 ml 离心管管中, 于700温育直直至胶完完全融化化. 加11 mll 树脂脂(reesinn), 混合220秒.(2

24、) 去去掉注射射器上的的推进器器，将MMiniicollumnn安上。(3) 将将树脂/DNAA混合液液移入注注射管中中，慢慢慢插入推推进器，轻轻轻将悬悬浮液推推进Miiniccoluumn中中。(4) 从从Minnicoolummn去掉掉注射器器，取出出推进器器。再安安注射管管于Miiniccoluumn上上。加22m1的的80%异丙醇醇于注射射管中洗洗Minnicoolummn。插插入推进进器，缓缓慢将异异丙醇推推过Miiniccoluumn。(5) 去去掉注射射器，将将Minnicoolummn放在在1.55ml离离心管中中，离心心2分钟钟，使树树脂/DDNA干干燥。(6) 将将Minn

25、icoolummn移入入一个新新的离心心管，加加50uul水或或TE，放放置1分分钟，离离心200秒，溶溶下DNNA片段段。(7) 仍仍掉Miiniccoluumn.纯化的的DNAA储藏于于4或-220。2.1.33 连接接在冰上建立立如下连连接体系系: 2*TT4 DDNA连连接酶BBufffer 5uuL PPlfyy-载体 11uL GGFP 33uL TT4 DDNA连连接酶 11uL轻轻混匀后后，4连接过过夜。 2.11.4 大肠杆杆菌DHH5感受态态细胞的的制备(1) 从从LB平板板上挑取取E.ccolii DHH5单菌落落接种于于2mLL LBB液体培培养基中中，377振荡培培养

26、过夜夜，取1100-2000uL菌液于于2mLL LBB中，337振荡培培养2-3小时时后全部部转入1100LLB中，337振荡培培养2-3小时时至对数数生长期期(ODD6000=0.4左右右)。 (2) 无菌条条件下转转入1.5mLL Epppenndorrf，冰冰浴100minn。(3) 4 40000rrpm 8miin，回回收细胞胞。(4) 用用4000uL冰冰预冷的的CaCCl2 (00.1MM)重悬悬沉淀，置置于冰上上15-30mmin。(5) 4 40000rrpm 8miin，回回收细胞胞。(6) 用用1000uL冰冰预冷的的CaCCl2 (00.1MM)重悬悬沉淀，备备用。

27、2.11.5 转化(1) 1100uuL感受受态细胞胞中加入入1.55uL质质粒，轻轻轻旋转转，混匀匀内容物物，冰上上 置300minn。 (2) 42水浴900s，不不要摆动动试管。 (3) 快速将将试管转转移至冰冰上，冷冷却2mmin。 (4) 每管加加入2000uLL LBB，377振荡455minn1hhr。 (5) 涂板(KKan)。 (6) 至液体体完全吸吸收后，倒倒置平板板，377培养。 2.1.66 提质质粒 用用小量碱碱法提取取质粒：取1.5mmL菌液液转移至至Epppenddorff管，于于4，1220000rpmm离心330”。(2)吸去去上清，空空气干燥燥沉淀。沉沉淀悬

28、浮浮于1000ull溶液中（225mMM Trris-HCll pHH8.00, 110mMM EDDTA, 500mM葡葡萄糖）中中，振荡荡混匀室室温放置置5分钟钟。(3)假如如2000ul溶液液（0.22M NNaOHH, 11%SDDS），放放冰浴中中5分钟钟。(4)再加加入1550ull溶液（3M NaAAc, pH44.8），放放冰浴中中5-110分钟钟，1220000rpmm 4离心55分钟。取取上清加加等量酚酚：氯仿仿，振荡荡，4，1220000rpmm 2分分钟。(5)取上上清加22倍体积积乙醇，振振荡，置置2分钟钟。(6)4，1220000rpmm 2分分钟，吸吸去上清清，沥

29、干干。(7)加11mL 70%乙醇洗洗涤2次次。(8)用550ull TEE溶解（加加入1uul RRnasse）。 2.1.77 酶切切鉴定及及PCRR鉴定 所所用限制制性内切切酶及PPCR引引物如前前2.11.1及及1.44所述。 2.2 GGUS活活性的组组织化学学定位部部分 2.2.1 组织培培养(1)将植植物长出出两周的的主根切切下成55-100mm的小小段，转转移至CCIM中中诱导其其长愈伤伤。(2)三周周后，将将愈伤组组织转移移至SIIM中诱诱导其长长芽。(3)设未未转基因因植物作作负对照照，对照照和处理理之间的的培养条条件要完完全一致致。(4)不论论在CIIM中还还是在SSIM

30、中中，培养养基要每每1-22周续代代一次，及及时更新新。(5)注意意大量培培养，在在由CIIM转移移至SIIM的同同时，应应保留一一部分材材料作CCIM续续代，以以此作为为SIMM培养下下的处理理的另一一种对照照。(6)实验验过程中中特别要要注意无无菌操作作！ 2.22.2 GUSS活性检检测(1)当植植物的根根在CIIM中培培养时，每每隔2-3天作作一次GGUS组组织化学学染色进进行跟踪踪监测。(2)当愈愈伤组织织在SIIM中培培养时，每每隔一周周左右作作一次检检测。等等到长出出再生芽芽和再生生根时，切切下芽和和根分别别作检测测。(3)未转转基因的的对照必必须和处处理始终终同步进进行。(4)

31、设置置重复，至至少3-5次。(5)具体体方法：无菌操作，将将要检测测的植物物部位小小心切下下来，转转入GUUS染液液，使材材料和染染液的体体积比1:55。真空处理22-100分钟。放入37恒温箱箱中温育育12-16小小时。待GUS渗渗入材料料中后，材材料转入入透明液液中透明明，放置置于室温温下3小小时。 22.2.3观察察和照像像 经透明明处理后后的植物物材料在在Mottic 解剖镜镜下观察察，有GGUS表表达的部部位显 现稳稳定、不不溶于透透明液的的蓝色。解解剖镜上上接理光光XR-X 220000相机照照相， 相片片通过AAcerr SccanPPrissa 6640UU型扫描描仪输入入电脑

32、，由由Adoobe Phootosshopp 6.0 作适适当处理理。2.3 整整体原位位杂交2.3.11 探针针标记 限制性性内切酶酶消化质质粒LFY：aantiisennse BaamH11Sensee KpnnI(1)377C 消消化2小小时，电电泳检查查线性化化是否完完全；(2)加等等体积酚酚-氯仿仿，混匀匀；(3)1220000转离心心10分分钟，收收集上清清，(4)加22倍体积积无水乙乙醇（预预冷），混混匀，-20CC，300分钟；(5)1220000转离心心10分分钟，弃弃上清，(6)加770%乙乙醇（预预冷），弃弃上清，(7)真空空干燥，沉沉淀溶于于10微微升无菌菌水中；(8)

33、电泳泳检测。体外转录(1)每个个反应体体系内含含：模板4微升升，5*缓冲液液4微升升，DTTT2微微升，RRNA Bloock 1uLL，5*NTPP 4微升升，Poolymmeraase 2微升升，DEEPC-H2OO 3微微升。337C 2小时时。LFY： anttiseensee T33Sensee T7(2)Dnnasee I 于377C处理理15分分钟以除除去模板板，每个个体系加加 2.5微升升的3MM NaaAc和和75微微升的预预冷的无无水乙醇醇，-220C 过夜，(3)4CC 下离离心155分钟，1130000转；(4)700%预冷冷的乙醇醇沉淀一一次，吹吹干后溶溶于500微升

34、DDEPCC-trreatted H2OO。碱性水解(1)500微升探探针加550微升升碳酸缓缓冲液，660C 水解，LFY45分钟， 每管加10微升5%乙酸，置冰上；(2)每管管加111微升的的3MnnaAcc，2000微升升预冷无无水乙醇醇，-220C 过夜；(3)4CC 下离离心155分钟，1120000转；(4)700%预冷冷的乙醇醇沉淀一一次，吹吹干后溶溶于500微升甲甲酰胺。2.3.22 原位位杂交(1)固定定FB 330miin甲醇 22次 55minn乙醇 4次 55minn(2)杂交交预处理理乙醇 2次次 2mmin1:1 乙乙醇:二甲苯苯 330miin乙醇 2次 5mii

35、n甲醇 2次次 55minn1:1 甲甲醇:PPBT 100minnPBT+55%甲醛醛 30mminPBT 3次 22minnPBT+440ugg/mLL 蛋白白酶K 110-115miinPBT+00.2% 甘氨氨酸 5miinPBT 2次 22minnPBT+55% 甲甲醛 30mminPBT 4次 2miin1:1 PPBT:HS 110miinHS 2次 22minn预杂交 22hr 60(3)杂交交400uLL HSS + 3uLL RNNA pprobbe + saalmoon ttestts DDNA (1000ugg/mLL)（探针和ssalmmon tessts DNAA预

36、先885变性55minn）16-200hr 60(4)杂交交后处理理HS 22次 330miin 551:1 HHS:NNTE 600minnNTE 600minnNTE 2mminNTE+440ugg/mLL Rnnasee A 45mmin 37NTE 15mmin 37NTE 55次 15mmin1:1 NNTE:PBTT 200minnPBT 2mminBS 至少330miin(5)检测测anti-DIGG抗体处处理等量混合固固定后的的和新鲜鲜材料+少量冰冰冷900%丙酮酮，液氮氮中磨成成细粉加入更多990%丙丙酮，使使劲混合合均匀，44储存过过夜13,0000g 5miin离心心，弃

37、上上清。在在少量990%丙丙酮中重重悬沉淀淀，将沉沉淀分散散于一滤滤纸上，风风干在30mgg干粉中中加入4400uuL BBS和220uLL annti-DIGG Faab ffraggmennt，室室温黑暗暗中244hr10,0000离心心3miin信号检测BS 1000uLL中加入入1uLL e中中上清，44过夜新鲜BS 110miinPBT 4次 60miinSB 2次 5mmin1mL中加加入8uuL RRochhe公司司的niitroo bllue tettrazzoliium chlloriide + 55-brromoo-4-chlloroo-3-inddolyyl-pphoss

38、phaate 5-660miin黑暗暗中显色色显色完毕后后用SSSB终止止反应 (6)观察和和照像用甘油:PPBS 7:33 溶液液封片，在在OLYMMPUSS显微镜镜下观察察并照像像，相片片通过AAcerr SccanPPrissa 6640UU型扫描描仪输入入电脑，由由Adoobe Phootosshopp 6.0作适适当处理理。 实验结果拟南芥中LLFY启启动子活活动特点点的验证证 白书农农教授等等早年曾曾利用PPlfyy:GGUS转转基因拟拟南芥为为材料，系系统检测测过在植植物发育育早期的的SAMM中和以以根为外外植体的的植株再再生过程程中Pllfy的的活动特特点。我我首先重重复了该该

39、实验，以以便熟悉悉各个步步骤和操操作，同同时也进进一步验验证该实实验的可可重复性性。 实实验方法法如2.2中所所述，结结果见图图1所示示。早在在幼苗长长出的第第二天，GUS活动就在SAM中表现出来（图1-A）。而在茎的其他部位、成熟的叶片和根中，没有Plfy的活动（图1-B）。为了避免SSAM中中已存在在的GUUS活性性干扰，本本实验以以无GUUS活动动的根为为外植体体进行植植株再生生。当将将根移入入CIMM中诱导导愈伤时时，第二二天就在在成熟根根外周区区域有细细胞分裂裂的地方方发现了了微弱的的GUSS表达（图图1-DD）。且且随着愈愈伤的生生长，GGUS活活性逐渐渐提高（图图1-EE至图11

40、-J）。本实验的结结果再次次验证了了在拟南南芥中，Plfy在早期即定位表达于SAM中，且在根外植体再生过程中有Plfy的活动。因为植株再生过程中涉及到SAM的重组，我们由以上两点推测Plfy的表达与SAM的形成与活动直接相关，但这个假设尚需进一步的实验结果验证。通过本实验，我熟练掌握了植物组织培养、GUS组织化学染色解剖观察和照相等各项实验技能，为进一步的工作打下了基础。LFY启动动子在烟烟草中与与在拟南南芥中有有相同的的活动特特点 为了了验证PPlfyy在拟南南芥中的的上述表表达特点点是否具具有普遍遍性，我我又利用用Plffy:GUSS转基因因烟草为为材料，用用与拟南南芥同样样的方法法分析P

41、Plfyy在早期期SAMM和根外外植体植植株再生生过程中中的活动动特点。实实验结果果如图22所示。与与拟南芥芥相似的的是，转转基因烟烟草的早早期SAAM（图22-A、2-B）和再再生芽原原基（图图2-CC、2-D、2-E）以及及再生芽芽分生组组织区域域（图22-F、2-G、22-H）中中都有明明显的GGUS表表达，但但转基因因烟草也也具有自自己的特特点，即即在茎尖尖中所检检测到的的GUSS染色水水平与同同时期的的拟南芥芥相比偏偏低，而而且用现现有的方方法，未未能检测测到早期期愈伤中中的GUUS活动动。 这个个实验证证明，LLFY基基因在植植物幼苗苗SAMM和叶原原基、芽芽原基中中的表达达特点是

42、具有普普遍性的的。而烟烟草早期期愈伤中中未能如如拟南芥芥那样检检测到GGUS反反应活 性，估估计可能能因为PPlfyy在烟草草中活动动强度太太低，但但该推测测尚需进进一步的的实验验验证。RNA水平平上的LLFY表表达特征征与GUUS检测测结果相相同考虑到现有有的文献献中所述述现象，启启动子的的研究不不能完全全反映基基因的真真实表达达情况（详详见引言言部分），要要想清楚楚地研究究其功能能，我们们必须直直接检测测该基因因的转录录产物。所所以我试试图用RRNA水水平整体体原位杂杂交的方方法，在在拟南芥芥不同发发育阶段段SAMM中和根根外植体体植株再再生过程程中对LLFY基基因的转转录产物物进行直直接

43、检测测和定位位。如果果LFYY基因确确实在RRNA水水平上存存在与启启动子相相同的表表达特点点，则表表明启动动子分析析结果是是可靠和和有意义义的，从从而进一一步验证证了我们们关于LLFY基基因功能能的假说说。否则则，则表表明过去去启动子子分析的的结果未未能反应应实际基基因表达达的状况况。详细流程如如实验方方法中所所述。首首先，要要想取得得好的原原位杂交交结果，先先需要一一个高质质量的探探针。我我用BaamHII和KpnnI双切切pDWW1244-LFFY质粒粒，切出出LFYY基因，检检测了该该质粒的的正确性性。然后后用BaamHII和KpnnI分别别从两端端单切，使使质粒线线性化。结结果如图图

44、1.11所示。转转录后结结果见11.2，水水解后结结果见11.3所示示。 图1：探针针制备电电泳图谱谱1.1: 质粒酶酶切图谱谱Lane 1: DL220000 DNNA MMarkker Lanne 22: LLFY/BammHI+KpnnI ，小小片段即即为切出出的LFFY基因因 Laane 3: LFYY/KppnI，已已线性化化完全 Lanne 44: LLFY/BammHI，已已线性化化完全 Lanne 55: LLFY质质粒对照照2: 转录录后电泳泳图谱（未未经Dnnasee处理）Lane 1: LFYY/KppnI （T7转录录酶） Lanne 22: LLFY/BammHI（T

45、3转录录酶） Lanne 33: CConttroll 箭头头所示为为转录出出的RNNA条带带3: 水解解后电泳泳图谱Lane 1: DL220000 DNNA MMarkker LLanee 2: LFFY/KKpnII Laane 3: LFYY/BaamHII Lanne 44: CConttroll 箭头头所示为为水解后后的RNNA小片片段 杂杂交结果果见图版版3。AA-D显显示的是是拟南芥芥发育过过程中的的LFYY基因表表达状况况。7天天大小、114天大大小的拟拟南芥幼幼苗以及及花序中中，LFFY基因因的表达达定位于于茎端分分生组织织和叶原原基、花花芽原基基中，而而在茎的的其他部部分

46、、花花梗、成成熟的叶叶片中，检检测不到到LFYY的表达达信号。 同同样以无无LFYY活动的的根为外外植体进进行植株株再生，现现已检测测到在CCIM中中培养44天的根根外植体体细胞分分裂旺盛盛的部位位中的LLFY表表达信号号（图44-E、图44-F）。后后续的检检测工作作正在进进一步进进行。 值值得注意意的是，用用原位杂杂交和用用GUSS组织化化学染色色检测的的结果显显示，LLFY的的活动和和LFYY启动子子的活动动确实是是一一对对应的（至至少现有有的结果果说明了了这一点点），这这初步证证明了过过去取得得的Pllfy活活动结果果具有一一定的可可靠性。Plfy:GFFP载体体的构建建 在在Plff

47、y:GUSS拟南芥芥根外植植体植株株再生过过程中，愈愈伤组织织中可发发现明显显的GUUS活动动，至于于有GUUS活动动的部位位是否会会出芽，目目前还不不得而知知，因为为组织化化学染色色将杀死死细胞，失失去继续续培养、跟跟踪观察察的可能能。也就就是说在在茎端分分生组织织形成之之前，我我们观察察到了LLFY的的活动；在茎端端分生组组织形成成之后，我我们又观观察到了了LFYY基因的的特异表表达。但但是茎端端分生组组织的这这团细胞胞是否来来自茎端端分生组组织形成成前有LLFY活活动的细细胞，目目前还没没有直接接的证据据。针对对这一问问题，我我打算构构建Pllfy:GFFP载体体并将其其转入拟拟南芥，从

48、从而能在在荧光下下跟踪检检测Pllfy的的活动。如如果Pllfy活活动部位位和出芽芽部位确确有一致致性，则则为我们们的假设设提供了了一个有有力的证证据。 目目前手头头上已具具有Pllfy:anntiLLFY和和Pnffl:GFPP质粒，在在anttiLFFY和GFPP两侧均均有XbbaI和和SaccI的酶酶切位点点，我用用这两种种限制性性内切酶酶将这两两种质粒粒切开，从从琼脂糖糖凝胶上上准确切切下载体体-Pllfy片片断和GGFP片片断，再再将二者者进行连连接。 首首先，我我用酶切切的方法法和PCCR的方方法检测测了Pllfy:anntiLLFY和和Pnffl:GFPP两个质质粒的正正确性。对

49、对于Pllfy:anntiLLFY，Plffy是构构建新载载体需要要的片段段，anntiLLFY却却是要用用酶正确确切下以以便置换换的片段段，所以以图3.1，3.22分别对对Plffy和anttiLFFY进行行了检测测，切出出的Pllfy 1Kbb左右，aantiiLFYY 1.4Kbb左右，均均和预期期相符。而而对于PPnfll:GGFP，GFPP既是新新载体需需要片段段，又是是要用酶酶切下的的，而PPnfll并没有有什么作作用，所所以只用用检测GGFP就就够了，这这里用了了酶切和和PCRR两种方方法，切切出的GGFP 7500bp左左右，PPCR条条带5000bpp左右，和和预期相相符。分

50、分别如图图3.33，3.44所示。由由图可见见，这两两个质粒粒均是可可用的。 连连接后，对对重组载载体进行行筛选。图图3.55显示酶酶切鉴定定Plffy的结结果，切切出的片片段大小小（1KKb左右右）与预预期相符符，而且且通过和和Plffy:anttiLFFY酶切切后的结结果并排排跑电泳泳，更充充分证明明了切出出的小片片段确实实是来自自于Pllfy:anntiLLFY的的Plffy。同同理，图图3.66，3.77通过与与Pnffl:GFPP并排作作酶切、跑跑电泳，证证明了切切出的小小片段是是来自于于Pnffl:GFPP的GFPP。Plffy:GFPP质粒构构建成功功。 图3：质粒粒Plffy:

51、GFPP的构建建图3.1: 检测测Plffy:anttiLFFY (Plffy)Lane 1: DNAA/EccoRII+HiindIIII DNAA Maarkeer LLanee 2: Pllfy:anntiLLFY plaasmiid LLanee 3: Pllfy:anntiLLFY/EcooRI+XbaaI LLanee 4: Pllfy:anntiLLFY/EcooRI+XhooI LLanee 5: Pllfy:anntiLLFY/EcooRI+KpnnI LLanee 6: Pllfy:anntiLLFY/PsttI+XXbaII Laane 7: Plffy:anttiLFF

52、Y/PPstII+XhhoI Lanne 88: PPlfyy:aantiiLFYY/PsstI+KpnnI LLanee 9: DLL20000 DDNA Marrkerr图3.2: 检测测Plffy:anttiLFFY（anttiLFFY）Lane 1: DNAA/EccoRII+HiindIIII DNAA Maarkeer LLanee 2: Pllfy:anntiLLFY质质粒 LLanee 3: Pllfy:anntiLLFY/XbaaI+SSacII Laane 4: Plffy:anttiLFFY/XXhoII+SaacI Lanne 55: PPlfyy:aantiiLFYY

53、/KppnI+SaccI LLanee 6: Pllfy:anntiLLFY/XbaaI+BBamHHI LLanee 7: Pllfy:anntiLLFY/XhooI+BBamHHI LLanee 8: Pllfy:anntiLLFY/KpnnI+BBamHHI LLanee 9: DLL20000 DDNA Marrkerr图3.3：检测PPnfll:GGFP（GFPP）Lane 1: DL220000 DNNA MMarkker Lanne 22: PPnfll:GGFP/XbaaI+SSacII Laane 3: Pnffl:GFPP质粒图3.4：检测PPnfll:GGFP（GFPP）

54、Lane 1: 以无菌菌水为模模板的PPCR产产物（负负对照） Lane 2: 正对照 Lane 3: 以Pnfl:GFP为模板的PCR产物 Lane 4: DL2000 DNA Marker图3.5: 新构构建的PPlfyy:GGFP酶酶切鉴定定（检测测Plffy）Lane 1: Plffy:anttiLFFY质粒粒 Laane 2: 新构建建的Pllfy:GFFP质粒粒 Laane 3: Plffy:anttiLFFY/PPstII+XbbaI Lanne 44: PPlfyy:GGFP/PsttI+XXbaII Laane 5: Plffy:GFPP/PsstI+BammHI Lanne

55、 66: PPlfyy:aantiiLFYY/EccoRII+XbbaI Lanne 77: PPlfyy:GGFP/EcooRI+XbaaI LLanee 8: Pllfy:GFFP/EEcoRRI+BBamHHI LLanee 9: DLL20000 DDNA Marrkerr图3.6: 新构构建的PPlfyy:GGFP酶酶切鉴定定（检测测GFPP）Lane 1: Pnffl:GFPP质粒 LLanee 2: Pnnfl:GFFP/XXbaII+SaacI Lanne 33: PPlfyy:GGFP/XbaaI+SSacII Laane 4: Plffy:GFPP质粒图3.7: 新构构建的PPlfyy:GGFP PCRR鉴定（检检测GFFP）Lane 1: DL220000 DNNA MMarkker Lanne 22: PPlfyy:GGFP PCRR产物 LLanee 3: Pnnfl:GFFP PPCR 产物 Lanne 44: 以以水为模模板的PPCR结结果 LLanee