EMSA操作方法(原核表达纯化蛋白)

1、三、凝胶滞留试验（S凝胶迁移滞留试验（electrophoreticmobilityshiftassays,EMSA）是研究核酸与蛋白质相互作用简单、快速、敏感的方法，目前已经成为转录因子研究的经典方法，并且用于研究RNA结合蛋白和特定的RNA序列的相互作用。其基本原理是蛋白质可以与末端标记的核酸探针结合，电泳时这种复合物比无蛋白结合的自由探针在凝胶中泳动的速度慢，即表现为相对滞后。（一）转录因子-标签融合蛋白和标签蛋白的原核表达纯化以标签为例。裂解液：25mp.ri、10（CilaCl2m2a、1m和1XCompleteProteaseInhibitorCocktail。洗脱液：50mMpH

2、7.8Tri、s-20H0mCMlNaC、l1mMDT、T0.02%（v/）vTriton1（和10m还原性谷胱甘肽。透析液：25mp.0ris-1mClet1m和1XComplete2ProteaseInhibitorCocktail。1将转化了口4载体或者口4目的基因重组载体的12大肠杆菌在5mL含100螃mL氨苄青霉素的L培养液中3、200rpm震荡培养12h。2取1mL菌液加入100mL含100%mL氨苄青霉素的L培养液中，3、200rpm震荡培养至为00.5左右。3加入IP至终浓度为0.5m,2、200rpm培养h4冰上放置10min,4、3000Xg离心15min,收集菌体并称重。

3、5每克菌体加入3mL裂解液，重悬菌体，加入溶菌酶至终浓度为0.5mgmL,在冰上温和地搅动菌液30min。超声波破碎30s（破碎10s停10s）。、12000Xg离心30min,上清液用0.45Mrn滤膜过滤，向滤液中加入5aCl使aCl的浓度为200m。去掉ltathioneepharose4ast中的储存液，用5倍树脂体积的裂解液清洗树脂。9待裂解液流到树脂上沿以下时，加入已过滤的菌体裂解液。流出液再过一次树脂，收集流穿液。10用5倍树脂体积的裂解液清洗树脂，收集洗涤液并置于冰上。11用5倍树脂体积的洗脱液洗脱目的蛋白，收集目的蛋洗脱液置于冰上。12洗脱结束后，用5倍树脂体积的裂解液清洗树

4、脂，收集清洗液置于冰上。用5倍树脂体积的双蒸水洗涤树脂，树脂保存于倍体积的20（）乙醇中。通过电泳分析流穿液、洗涤液、目的蛋洗脱液和清洗液中出现的目的蛋白。15用截留分子量不大于目的蛋白分子量1/的3超滤管超滤纯化目的蛋白，并加入透析液继续超滤至合适的体积，转移到51离心管中，2保存。（二）蛋白质浓度的法测定用m公司生产的蛋白定量分析试剂盒测量蛋白质溶液的浓度。用透析液稀释2000呢mL标准蛋白质溶液，得到浓度分别为0、25、25250、500、500005002000螃mL的标准蛋白质溶液。2液与液按50：的体积混匀，得到WR液。将200瓦WR液分别与25应不同浓度的标准蛋白质溶液混匀，封口

5、，7温育0m。冷却至室温后测量52波长的吸光值，测次，取平均值。做出标准曲线。5将25配待测蛋白质溶液加到200配WR液中，混匀，封口，7温育0m。冷却至室温后测量52波长的吸光值，测次，取平均值。根据标准曲线得出待测蛋白质溶液中的蛋白质浓度。（三）转录因子直接结合的验证公司生产的DeeoM检测性物素标记探针。1配制非变性凝胶：1800双双蒸水、3500瓦1XTBE缓冲液(50mMTrs硼酸和2mMaEDT)、1400凡30%()rB(2S：1)、219瓦80%()甘油、52.5配10%()和3.5瓦TEMED。2配制4义结合缓冲液：200mMp8.0Trs、C4mMaEDT、00nMCl24

6、mMDTT；3配制结合反应液：5配4义结合缓冲液、1配poly(dIdC、5%纯化蛋白和0.1pM生物素标记探针，用双蒸水补至20瓦。竞争反应加入相应量的非标记探针。室温下放置1h。4小型垂直电泳槽放置在冰中，将结合反应液加入非变性凝胶的进样孔中，在0.5XTBE缓冲液中100电压电泳0m。5剪出与凝胶大小相当的尼龙膜和滤纸(4张)，将尼龙膜和滤纸在0.5XTBE中浸泡10m以上。在半干转膜仪中加入0.5义18,依次铺上2层滤纸、尼龙膜、凝胶、2层滤纸，每层之间不能有气泡。500m电转1h。移走滤纸将尼龙膜取出，在超净台紫外灯下约10m处紫外交联10m8从冰箱取出BloBufer和4XWash

7、buffer,置3烘箱，使白色沉淀溶解。9将尼龙膜放在9将尼龙膜放在5mLBlogBuffer轻微振荡15morsPereardoixsihdaseugate/BlockiugorsPereardoixsihdaseugate/Blockiugg轻微振荡10将1.uLabledrepadCouga加e到5mLBloBufer中（1300稀释）配制CoBuffer。倒出BlogBuf加入CougaeBlo15miu。11用4XWashbuffer加纯水配制40mL1XWashbuffer。12将膜移动到新容器中，用10mL1XWashbuffer洗涤尼龙膜4次，每次5m,轻微振荡。13将膜移动到

8、新容器中，加入10mLSubstrateEquilibratiou，Buffer轻微振荡5m14将结合膜取出放置到滤纸上，吸掉水分，再放到新的滤纸上。在暗室中将和等体积混合配制，将加到尼龙膜上。用保鲜膜覆盖尼龙膜，放上感光片，曝光，显影，拍照。蛋白原核表达及激酶活性测定吴赴清提供一、蛋白原核表达（一）载体选择1、蛋白表达的载体系统很多，常用的有pET系统（有his-tag）,pGEX-4T-1（GSTtag）,pMAL系统（MBPtag）。2、由于pET系统标签小，纯化洗脱都比较方便，因此一般首选这个系统;如果pET表达困难，可以考虑用pGEX-4T-1和pMAL系统，GST标签与MBP标签一

9、方面都可以增加蛋白的可溶性，另一方面也利于增加难表达蛋白的表达水平。二者的区别是某些情况下，pMAL系统表达复杂结构蛋白能力更强些，但MBP融合蛋白不容易从树脂上洗脱下来。（二）表达菌株表达菌株使用最多的是BL21（DE3），另外对某些表达特别困难的蛋白也可以选用由这个菌株优化的新菌株，如rostta（DE3）,BL21（DE3）plysS等。（三）融合蛋白表达纯化1、His蛋白表达纯化（1）测序正确的质粒转化BL21（DE3）感受态细胞，涂板后培养8-16h。（2）挑取3单菌落接种于5mlLB培养基中，37摇菌至OD60（=0.6。（3）取1ml菌液保存菌种，取2ml加入IPTG使终浓度为1

10、mM，16，160rpm,16h诱导，另2ml不加IPTG，16，160rpm,16h，作未诱导对照。（4）诱导结束后，诱导和未诱导的，各取1ml,10000rpm离心1min,去上清，沉淀中加入50plPBS重悬，再加入50pl2x蛋白上样缓冲液，100煮样5min,10000rpm离心5min,得至的上清为总蛋白。取10-20pl电泳检测目的蛋白表达情况。（5）如果要检测表达的蛋白是在上清中还是在沉淀中，则按下面步骤进行：取5ml诱导和5ml未诱导菌液，离心收集沉淀，加入300-500ulPBS重悬，超声破碎，至菌体变为澄清，12000rpm离心5min,取50ul上清加入50ul2x蛋白

11、上样缓冲液；取沉淀加入100-200ulPBS,再加入等体积2x蛋白上样缓冲液，100煮样5min,10000rpm离心5min,取10-20pl电泳检测目的蛋白表达情况。（6）融合蛋白纯化如果小量诱导发现蛋白有表达，则进行纯化，下面以1升LB为例介绍纯化过程。1）诱导完毕后，7000rpm,4，离心5min收菌。沉淀可在-20保存数月。2）用40ml冷PBS重悬细胞沉淀，加入蛋白酶抑制剂cocktail（Roche），和2mMDTT,200plTritonX-100轻微涡旋混匀。4）超声破碎细胞，至菌体澄清，12000rpm，4，离心10min，小心转移上清到一个新的50ml离心管中。5）取

12、0.5-1mlNi-NTiBind树脂到结合柱中，让液体流下，加入2x5mlPBS漂洗树脂，结束后将树脂加到4）的蛋白上清中。6）将离心管封严平放在冰盒中，摇床上100rpm摇动结合1-2h。7）将上述结合混合物上柱子，让溶液流出，收集树脂。8）用3X5ml冰中预冷的PBS漂洗树脂。9）配制梯度咪唑溶液（100mM、200mM、300mM、400mM、500mM）放置冰中，分别用500ul上述溶液从低浓度到高浓度依次洗脱目的蛋白。10）从各管中取5ul蛋白加入等体积loadingbuffer，煮样后电泳。3M咪唑：咪唑分子量为68.08，先称取20.4g咪唑放入60ml水中，溶解后定容到100

13、ml。(2)GST融合蛋白表达纯化GST融合蛋白表达纯化的大部分步骤与HIS融合蛋白相同，不同的主要有如下几点：1)为了产生尽量多的可溶蛋白，诱导用IPTG浓度一般为0.1mM;2)蛋白与树脂混合物结合完毕后750g，离心1min，4C，沉淀树脂。将树脂与少量上清混合物上柱，用冰预冷的PBS5ml漂洗树脂3次。这个混合物可保存于4C用于进行pull-down实验。或进行融合蛋白洗脱。3)10 xGST融合蛋白洗脱溶液500mMTris-Cl(pH8.0)+200mM还原型谷胱甘肽还原型谷胱甘肽在溶液中不稳定，要将母液分装后存在-20冰箱中，避免反复冻融。pH值很关键，必须用8.0的PBS.这样洗脱下来的蛋白溶液中包含高浓度的谷胱甘肽，如果它对下游的实验有影响可以通过超滤等手段去除。)对洗脱下来的蛋白进行SDS电泳，检测蛋白纯化情况。GST标签的大小为26KDa。)如果要立即使用融合蛋白，可在4存放1周，如果要长期保存，可以加入甘油使终浓度为50%，存放于-20。)增加可溶性蛋白含量的方法：主要是通过减慢融合蛋白表达速度实现，措施包括降低诱导温度、降低IPTG浓度、降低转速。在菌体悬浮时加入去污剂，如0.1%tritonX-100。或者可以纯化包涵体蛋白，然后