生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化课件

1、生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化1生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化1生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化三个关键问题:目标蛋白分子病理条件下的大小可能变化。保护措施到位，避免目标蛋白分子的技术性降解（ -70C条件下保存， 实验操作通常在冰浴下进行， 充分使用蛋白酶抑制剂）。选择合适的分离与纯化方案。2生物系统中目标蛋白分子的分离与纯化三个关键问题:2分离纯化目标蛋白分子的来源:一个最基本的原则是方便大量得到。牛、猪、马、兔和鼠等动物的肝脏或其他脏器组织。患者的手术组织标本。培养的人或其他哺乳动物细胞。细菌或酵母菌。基因克隆表达。3分离纯化目标蛋白分子的来源:3分离纯化目标蛋白分子的方法:盐

2、析法。有机溶剂沉淀法。等电点沉淀法。吸附法。结晶法。电泳法。超速离心法。柱层析法。4分离纯化目标蛋白分子的方法:4盐析法分离纯化目标蛋白分子的原理:蛋白质的溶解度，在低盐浓度范围随着盐浓度的升高而逐渐升高。此过程叫做盐溶(salting-in)。当盐浓度达到一定程度后，再增加盐浓度，此时蛋白质的溶解度不是随着盐浓度的升高而升高，而是逐渐降低，在溶液中出现蛋白质沉淀析出。此过程叫做盐析(salting-out)。不同蛋白质发生盐析时的盐浓度是不同的。这是蛋白质分子的一种特点。利用这一特点可对目标蛋白分子实施分离纯化。这种方法叫做盐析法。5盐析法分离纯化目标蛋白分子的原理:5-0.60.40.20

3、.0-0.2| | | | 等电点pH时，中性盐对碳氧血红蛋白溶解度的影响离子强度（）lg蛋白质溶解度1.0 2.0离子强度 （ionic strength）计算公式： C nZn2/2。C：各种离子的摩尔浓度，Z：各种离子的所带电荷数。 0.5MK2SO4的离子强度(1 12+0.5 22)/2=1.5。1MNaCl的离子强度(1 12+1 12)/2=1。6-0.6| OHH+_+_+_+_+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH

4、OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_蛋白质盐溶过程示意图OHHOHHOHHOHH蛋白质分子正负盐离子7OHH+_+_+_+_+_OHHOHHOHHOHHOOHH+_+_+_+_+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH+_OHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHHOHH_OHHOHH_蛋白质盐析过程示意图8OHH+_+_+_+_+_OHHOHHOHHOHHO蛋白质盐析实验用盐（

5、中性盐）及其优缺点盐优点缺点硫酸铵1）溶解度大，2）溶解度变化温度系数小，3）廉价易得，4）不易引起蛋白质变性，5）分段效果较好。1）对蛋白氮的测定有干扰，2）缓冲能力较差。硫酸钠1）对蛋白氮的测定无干扰，2）廉价易得，3）盐析免疫球蛋白效果不错。1）30C一下溶解度低， 2）溶解度变化温度系数大。磷酸钠1）效果有时优于硫酸铵，2）对蛋白氮的测定无干扰，3）廉价易得。1）溶解度低，2）溶解度变化温度系数大。氯化钠1）对蛋白氮的测定无干扰，2）廉价易得。1）溶解度较低，2）溶解度变化温度系数大。硫酸镁1）对蛋白氮的测定无干扰，2）廉价易得。1）溶解度较低，2）溶解度变化温度系数大。9蛋白质盐析实

6、验用盐（中性盐）及其优缺点盐优点缺点硫酸铵1）溶蛋白质盐析实验需要注意的几个问题盐的使用浓度：不同蛋白质的盐析所要求的盐浓度不同。分离混合组分蛋白质时，盐的浓度由低到高渐次增大。每出现一种蛋白质的沉淀时，则进行离心或过滤，分离所沉淀蛋白质，再继续增加盐的浓度，使第二种蛋白质沉淀。一个例子：用盐析分离血浆中蛋白质，1)硫酸铵浓度20时纤维蛋白原析出；2)硫酸铵浓度2833时，优球蛋白析出；3)硫酸铵浓度3350时，拟球蛋白析出；4)硫酸铵浓度50以上时，白蛋白析出。10蛋白质盐析实验需要注意的几个问题10蛋白质盐析实验需要注意的几个问题pH值：通常选择目标蛋白的等电点。蛋白质浓度：在相同盐析条件

7、下，蛋白质浓度越大越容易沉淀析出，但蛋白质浓度过大容易引起其他杂蛋白的共沉淀析出。温度：浓盐对蛋白质有一定的保护作用，因此蛋白质盐析操作通常在室温下进行。至于那些对热敏感的酶，则宜维持在低温4C条件下进行盐析。脱盐：透析法。11蛋白质盐析实验需要注意的几个问题11透析缸透析液（蒸馏水或缓冲液，加入防腐剂）透析袋（半透膜）蛋白质溶液蛋白质透析脱盐，4C下12透析缸透析液（蒸馏水或缓冲液，加入防腐剂）透析袋（半透膜）蛋蛋白质超过滤脱盐，4C或0C下蛋白质溶液半透膜支持栅板离心管13蛋白质超过滤脱盐，4C或0C下蛋白质溶液半透膜支持栅板离柱层析法 (Column chromatographic me

8、thod) 离子交换柱层析（Ion-exchange column chromatography）分子筛柱层析（Molecular sieve column chromatography）反向柱层析（Reverse-phase column chromatography）疏水柱层析（Hydrophobic interaction column chromatography）亲和柱层析（Affinity column chromatography）14柱层析法 (Column chromatographic m大分子小分子凝胶颗粒装载小分子的凝胶颗粒分子筛柱层析（Molecular sieve

9、column chromatography)凝胶过滤层析（Gel filtration column chromatography)凝胶渗透层析（Gel permeation column chromatography)15大分子小分子凝胶颗粒装载小分子的凝胶颗粒分子筛柱层析（Mol+Affinity chromatographyTarget proteins Other proteinsAgarose Ligand 1234516+Affinity chromatographyTargetDNA affinity chromatography-1 ACGT TGCAACGT TGCAACGT 1 Sepharose 4B-dsDNA2 Target proteins3 Other proteins17DNA affinity chromatography-1 ACGT TGCADNA affinity chromatography-2