植物组织培养的一些注意事项

1、PAGE PAGE 22植物组织培养的一些注意事项一、常用培养基主要特性1、高盐成成分培养养基包括括MS、LS、BL、BM、ER 等培养养基。其其中MSS 培养养基应用用最广泛泛,其钾盐盐、铵盐盐及硝酸酸盐含量量均较高高, 微量量元素种种类齐全全, 其养养分数量量及比例例均比较较合适, 广泛泛用于植植物的器器官、花花药、细细胞及原原生质体体的培养养。LSS、BM、ER 培养基基由MSS 培养养基演变变而来。2 、硝酸酸钾含量量较高的的培养基基包括BB5 、N6 、LH、GS 等培养养基。B5 培培养基BB5 培培养基除除含有较较高的钾钾盐外, 还含含有较低低的铵态态氮和较较高的盐盐酸硫胺胺素,

2、 较适合合南洋杉杉、葡萄萄及豆科科与十字字花科植植物等的的培养。N6 培培养基NN6 培培养基( 朱至至清等119755 ) 系我国国学者创创造, 获国家家发明二二等奖, 适用用于单子子叶植物物花药培培养, 柑橘花花药培养养也适合合, 在楸楸树、针针叶树等等的组织织培养中中使用效效果也好好。SH 培培养基是是矿盐浓浓度较高高的一种种培养基基, 其中中铵与磷磷酸是由由磷酸二二氢铵( NH44 H22 POO4 ) 提供供的, 这种培培养基适适合于某某些单子子叶及双双子叶植植物的培培养。3 、中等等无机盐盐含量的的培养基基H 培养养基本培培养基大大量元素素约为MMS 培培养基的的一半, 仅磷磷酸二

3、氢氢钾及氯氯化钙稍稍低, 微量元元素种类类减少, 而含含量较MMS 为高高, 维生生素种类类比MSS 多。适适于花药药培养。尼奇培养养基(NNiottschh 19969 ) 此此培养基基与H 培养基基成分基基本相同同, 仅生生物素比比H 培养养基高110 倍倍。也适适合于花花药培养养。米勒培养养基(MMilller 19663 ) 此培培养基和和Blaaydees(119666) 培培养基二二者成分分完全相相同。适适合大豆豆愈伤组组织培养养和花药药等培养养用。4 、低无无机盐培培养基大大多情况况下用于于生根培培养基。有有以下几几种:改良怀特特培养基基(Whhitee 19963 )WS 培培

4、养基(Wollterr & Skooog 19666)克诺普液液( KKnopp 19965 ) 花花卉培养养上用得得多。贝尔什劳劳特液(Berrtheelott 19934)HB 培培养基( Hoolleey & Baakerr 19963) 此培培养基在在花卉脱脱毒培养养和木本本植物的的茎尖培培养中效效果良好好。其成成分是大大量元素素比1/ 2 克诺普普( KKnopp ) 液稍多多, 微量量元素用用贝尔什什劳特液液, 每升升培养基基中加00 . 5mll。二、与培养养基有关关的一些些细节问问题1、培养基基所用药药品应采采用等级级较高的的化学纯纯CP(三级) 及分极极纯ARR(二级级) ,

5、 以免免杂质对对培养物物造成不不利影响响。2、调节PPH也可可用精密密pH试纸纸(应在干干燥器中中保存, 以免免吸湿而而失效)。培养养基过酸酸的可用用1mool/ L 氢氢氧化钠钠( NNaOHH) 来来调节; 培养养基过碱碱的可用用1mool/ L 盐盐酸( HCll ) 来调节节( 11moll/ LL NaaOH 的配制制方法是是称400gNaaOH, 溶解解后加入入蒸馏水水, 定容容到1 0000ml 即可。11moll/ LL HCCl 的的配制方方法是量量取122moll/ LLHCll 844ml , 加加水定容容至1 0000ml)。经高高压蒸汽汽灭菌后后, 由于于某些成成分的

6、分分解(如蔗糖糖的分解解) 或氧氧化, 酸度会会增加( pHH 值一一般可降降低0 . 22 )。有有时玻璃璃器皿质质量较差差, 其中中一部分分物质溶溶解, 也会影影响酸度度的变化化。这些些在调整整pH 值时都都要考虑虑进去。分分装后应应立即灭灭菌, 若因故故不能及及时灭菌菌, 最好好放入冰冰箱中在在24hh 内完完成灭菌菌工作。灭灭菌时压压力表读读数为00 . 8kgg/ ccm2 1 . 1kkg/ cm22 , 1211时保持持15mmin20mmin 即可。3、某些生生长调节节物质, 如吲吲哚乙酸酸、玉米米素及某某些维生生素等物物质遇热热不稳定定, 因此此不能进进行高压压灭菌, 而需需

7、用过滤滤方法灭灭菌, 经过过滤灭菌菌的溶液液, 可在在琼脂培培养基温温度下降降到大约约40时加入入到已高高压灭菌菌的培养养基中。4、配好的的培养基基可放到到培养室室中预培培养3dd ,若没没有污染染反应, 则证证明是可可靠的, 可以以使用。暂暂时不用用的培养养基最好好置于110下保存存, 含有有生长调调节物质质的培养养基在445低温下下保存则则更理想想。含吲吲哚乙酸酸或赤霉霉素的培培养基应应在配制制一周内内用完, 其他他培养基基至多也也不能超超过一个个月。一一般情况况下, 两周内内应用完完, 以免免干燥变质。三、培养材材料及消消毒1、取材季季节的影影响：大大多数植植物应在在其生长长开始的的季节

8、采采样, 生长末末期或已已进入休休眠期, 则外外植体对对诱导反反应迟钝钝或无反反应。2、器官的的生理状状态和发发育年龄龄：沿植植物的主主轴, 越向上上的部分分所形成成的器官官其生长长的时间间越短, 其生生理年龄龄也越老老, 越接接近发育育上的成成熟, 越易形形成花器器官。反反之, 越向下下, 其生生理年龄龄越小。木木本植物物的组织织培养中中, 以幼幼龄树的的春梢嫩嫩枝段或或基部的的萌条较较好, 下胚轴轴与具有有3 对4 对真真叶的嫩嫩茎段, 生长长效果也也较好 。一般般情况下下, 幼年年组织比比老年组组织具有有较高的的形态发发生能力力。3、材料大大小的影影响：材材料越小小成活率率越低, 茎尖尖

9、培养存存活的临临界大小小应为一一个茎尖尖分生组组织带11 个2 个叶叶原基, 约0 .2mmm0 .3mmm 大小小。叶片片、花瓣瓣等约为为5mmm2 , 茎段则则长约00 .55mm。因因此, 除非用用于去除除病毒否否则不宜宜将外植植体切的的过小。但但并不是是说外植植体越大大越好, 外植植体过大大易造成成污染, 有实实验证明明外植体体越大污污染率越越高。4、材料的的灭菌：一般是是组织越越大越易易污染, 夏季季比冬季季带菌多多，甚至至不同年年份污染染的情况况也有区区别。取取材最好好选在中中午或下下午, 避开阴阴雨天取取材可减减少污染染率。消消毒是为为了消灭灭病菌, 以保保证无菌菌组织培培养的进

10、进行。但但不同植植物及一一株植物物不同部部位的组组织, 其带菌菌程度不不同, 它们对对不同种种类、不不同浓度度的消毒毒剂的敏敏感度也也不一样样。最初初所使用用的消毒毒剂种类类, 浓度度及消毒毒时间的的长短都都要进行行摸索, 以达达到最佳佳的消毒毒效果。材料有绒毛毛最好在在消毒液液中加入入几滴吐吐温- 80 ,对与与难消毒毒的根及及地下部部位材料料 可将将其浸入入消毒液液中进行行抽气减减压, 以帮助助消毒液液的渗入入, 从而达到到彻底灭灭菌的目目的。潘潘学峰等等( 119988) 报报道, 12% 的双双氧水+ 0 .1%的升汞汞混合液液对南方方地下茎茎生姜灭灭菌100minn 的效效果最好好。

11、四、材料的的接种1、接种室室的消毒毒：植物物组织培培养技术术实际上上是一种种无菌操操作和无无菌培养养技术, 做好好接种室室的消毒毒是至关关重要的的。污染染的主要要来源是是空气中中的细菌菌和真菌菌孢子, 因此此, 每次次接种前前应进行行地面的的清洁卫卫生工作作, 并用用70%酒精喷喷雾使空空气的灰灰尘沉降降, 并用用紫外线线灯照射射20mmin。接种种前超净净工作台台面要用用新洁尔尔灭或酒酒精擦洗洗,并定期期清洗过过滤膜, 以延延长使用用寿命。2、无菌操操作要求求：工作作人员使使用的工工作服、帽帽子、口口罩等, 要经经常保持持干净, 并定定期进行行消毒, 即将将洗净、晾晾干的衣衣帽、口口罩等用用

12、纸包好好后与培培养基一一起进行行高压灭灭菌。工工作人员员的头发发、衣服服、手指指中都带带有许多多杂菌, 为此此要穿上上工作服服, 戴上上帽子, 也必必须剪除除指甲, 并用用肥皂擦擦洗, 最好再再在新洁洁尔灭溶溶液中浸浸泡100min , 接种种操作前前则用770%酒酒精擦洗洗。工作作人员的的呼吸所所产生的的污染, 主要要是在接种时谈谈话或咳咳嗽所引引起的, 因此此, 在操操作时应应禁止谈谈话并应应戴上口口罩。3、材料的的分离、切取和和接种切割动作要要快, 防止挤挤压使材材料受损损伤而招招致培养养失败, 也要要避免使使用生锈锈的刀片片, 以防防止氧化化现象产产生。接接种时要要防止交交叉污染染的发

13、生生,刀和镊镊子等接接种工具具使用一一次应放放入700% ( 或95%)酒精精中浸泡泡, 然后后灼烧放放凉备用用。接种时轻轻轻取下封封口纸, 动作作要慢以以免气流流冲入瓶瓶中造成成污染。将将瓶口靠靠近酒精精灯火焰焰, 瓶口口倾斜, 以免免空气中中的微生生物落入入瓶中,将瓶口口外部在在灯焰上上燎数秒秒钟, 将灰尘尘杂物等等固定在在原处, 然后后用镊子子将外植植体送入入瓶中, 材料料在培养养容器内内的分布布要均匀匀, 以保保证必要要的营养养面积和和光照条条件。茎茎尖、茎茎段等基基部插入入固体培培养基中中, 叶片片通常将将叶背接接触培养养基, 这是由由于叶背背气孔多多, 利于于吸收水水分和养养分的缘

14、缘故。五、材料的的初代培培养1、实验方方案的设设计1）、单因因子实验验设计：单因子子实验是是组织培培养中最最常用的的实验方方法, 尤其在在选择适适当的激激素种类类和浓度度配比上上使用最最多。2 ）、正正交实验验设计植植物离体体培养的的成功是是由多种种因素决决定的。正正交设计计是多因因素分析析的有力力工具, 它可可以很方方便的从从众多因因素中选选出主要要影响因因素及最最佳水平平, 因为为它可以以用较少少的实验验次数得得到较多多的信息息。例如如, 一个个7 因素素水平的的实验, 若将将各因素素水平全全部组合合都做一一遍, 需要27 = 1288 次, 而正正交设计计只需做做8 次实实验就可可以了,

15、 虽然然实验次次数减少少了, 但因为为各因素素水平搭搭配均匀匀, 88 次实实验基本本代表了了全部实实验的情情况。正交实验的的设计, 主要要工具是是正交表表。大多多数生物物统计学学书都列列出了可可供选择择的正交交表,如L4 ( 23 ) , LL8 (227 )见(表2 - 111 , 表2 - 122) 。字字母L 右下角角号码88 表示示它有88 个实实验要做做, 括号号内的指指数7 表示这这张表所所安排的的实验最最多可考考察7 个因素素(也可安安排2 个6 个, 超过过7 个要要选择其其他正交交表) , 底底数2 表示被被考察的的因素只只要求两两个水平平。在进进行实验验前可根根据要测测试

16、因素素的多少少及每种种因素所所考察的的水平, 选择择适合的的正交表表, 然后后按表进进行实验验。现举举一个例例子来说说明, 设影响响某种植植物试管管苗生长长的因素素有光照照时间、光光照强度度、pHH 值、温温度、蔗蔗糖浓度度、BAA浓度、NNAA 浓度7 个因素素, 每个个因素选选择两个个水平, 即, 光照照时间( 100h , 144h )、光照照强度(10000lxx , 20000lxx )、pH 值( 55 . 5 , 5 . 88 )、温温度( 20, 225) 、BA 浓度( 0 . 5 , 22 . 0 )、NAAA 浓度度( 00 . 5 ,1 . 0)、蔗糖糖浓度(2% ,

17、44%)。现现根据因因素和水水平的多多少选择择一个适适合本实实验的正正交表, 选L8 (227)最理想想, 填表表时, 因素水水平对号号入座, 见表表( 22 - 13 )。第第一号实实验是光光照时间间10hh/ dd、光照照强度110000lx、pH 值5 . 5、BA 浓度2 . 00、NAAA 浓度度0 . 5、蔗蔗糖浓度度4% , 其其他实验验依次类类推。根根据8 个实验验结果, 如出出苗数量量、苗高高、生根根数、移移栽成活活率等, 综合合考虑, 根据据需要选选取各最最适培养养条件。也也可通过过一定的的计算方方法(参考统统计学书书) , 算出出极差( R) , 极差(RR) 表表示每个

18、个因素在在实验中中所起作作用的大大小, R 越越大表示示该因素素的不同同水平对对实验结结果的影影响越大大, 但若若没有可可计算的的指标时时, 还是是选择单单因子实实验较好好。初代培养物物的建立立1）、保证证无菌2）、条件件合适：首先, 一定定要选择择好合适适的作物物种类、品品种及培培养的部部位; 其次,一定要要选择合合适的培培养基, 激素素及其他他添加物物; 还还要注意意掌握适适宜的环环境条件件。所以以在进行行一种植植物的组组织培养养之前, 应查查找该种种植物有有关方面面的资料料, 根根据这种种植物过过去所采采用的培培养部位位、培养养基、培培养条件件和培养养技术等等, 再再决定自自己的工工作步

19、骤骤。3）、操作作技术过过关3、污染的的防治1）、植物物材料的的选择及及防止污污染通常多年生生的木本本材料比比一二年年生的草草本材料料带菌多多; 老老的材料料比幼嫩嫩的材料料带菌多多; 田田间生长长的材料料比温室室生长的的材料带带菌多; 带泥泥土的材材料比不不带泥土土的材料料带菌多多。为此此对于培培养材料料的取材材就应很很认真地地加以选选择, 以减少少污染的的发生。用茎尖作外外植体时时, 应应在室内内或无菌菌条件下下对枝条条进行预预培养。将将枝条用用水冲洗洗干净后后插入无无糖的营营养液或或自来水水中, 使其发发枝, 然后以以这种新新抽的嫩嫩枝条作作为外植植体, 便可大大大减少少材料的的污染。或

20、或在无菌菌条件下下对采自自田间的的枝条进进行暗培培养, 待抽出出徒长的的黄化枝枝条时取取材, 也可明明显地减减少污染染。对木本植物物等难以以消毒的的材料可可采用多多次灭菌菌法。如如将切好好的外植植体放入入1 . 3%次氯酸酸盐溶液液中(商商品漂白白粉255%的溶溶液)消消毒300minn , 然后用用无菌水水冲洗33 次, 再放放在无菌菌条件下下,次日日用2 . 66%次氯氯酸钠灭灭菌300minn , 然后用用无菌水水冲洗33 次。也也可采用用多种药药液多次次浸泡法法,以加加强灭菌菌效果。材料内部易易感染病病菌, 在这种种情况下下, 必必须在培培养基中中加入抗抗生素类类, 防防止初代代培养物

21、物污染。、人为污染染的防止止接种前应用用肥皂将将手仔细细洗净后后, 再再用700%酒精精擦洗双双手, 并需及及时剪除除指甲。在在工作中中特别要要注意避避免交叉叉感染, 双手手必须清清洁, 工具则则用一次次即需消消毒一次次。工作作人员呼呼吸所产产生的污污染, 主要是是接种时时说话或或咳嗽所所引起的的, 因因此, 操作时时严禁谈谈话, 并应戴戴上口罩罩, 也也应穿工工作服, 戴工工作帽。污染中特别别注意一一种呈乳乳白色的的细菌污污染, 这种细细胞为芽芽孢杆菌菌。法国国林木育育种协会会鉴定为为迟缓芽芽孢杆菌菌( BBaciilluus llenllus) , 它外被被荚膜, 耐高高温, 一般消消毒剂

22、难难以杀死死。它可可随培养养材料、用用具等传传播; 它可出出现在培培养基表表面, 或呈滴滴形云雾雾状存在在于培养养基内。若若出现应应严格灭灭菌, 清洗用用具, 更换消消毒酒精精。4、防止外外植体褐褐变1）、褐变变的影响响因素褐变是由于于组织中中的多酚酚氧化酶酶被激活活, 使使细胞的的代谢发发生变化化, 酚酚类物质质被氧化化后产生生醌类物物质, 这类物物质呈棕棕褐色, 它们们会逐渐渐扩散到到培养基基中, 抑制其其他酶的的活性, 毒害害培养的的材料。褐褐变的影影响因素素是复杂杂的, 随植物物种类、基基因型、外外植体的的部位及及生理状状况等的的不同而而危害的的程度也也有区别别。材料本身的的生理状状态

23、不同同, 接接种后褐褐变的程程度也不不同。如如在欧洲洲栗的培培养中, 用幼幼年型的的材料培培养含醌醌类物质质少, 而用成成年型材材料培养养时含醌醌类物质质多。而而在卡德德利亚兰兰的培养养中, 较短的的新生茎茎致褐物物质含量量高, 而较长长的新生生茎致褐褐物质含含量低, 另外外致褐物物质的含含量也因因季节的的不同而而不同, 冬季季褐变少少, 夏夏秋季褐褐变最严严重, 存活率率最低。在在枝条上上取芽的的时期及及所取部部位不同同也有区区别, 如欧洲洲栗取11 月后后半月的的芽培养养则醌的的形成少少, 而而在5 月66 月取取芽培养养则醌类类物质发发生严重重。在第第一至第第四个芽芽的生长长期单宁宁类物

24、质质合成多多, 因因此, 接种后后褐变也也严重。油油棕用幼幼嫩外植植体( 如胚)培养较较少褐变变, 而而用高度度分化的的叶片接接种后则则容易褐褐变。总总之, 分生部部位接种种后形成成的醌类类物质少少, 而而分化的的部位则则形成的的醌类物物质较多多。培养基成分分过高的的无机盐盐浓度会会引起棕棕榈科植植物外植植体酚的的氧化。例例如油棕棕用MSS无机盐盐培养基基容易引引起外植植体的褐褐变, 而用降降低了无无机盐浓浓度的改改良MSS 培养养基时则则可减轻轻褐变, 而且且可获得得愈伤组组织和胚胚状体。激激素使用用不当时时, 材材料也容容易褐变变。细胞胞分裂素素6 - 苄基基氨基嘌嘌呤或激激动素有有刺激多

25、多酚氧化化酶活性性提高的的作用, 这在在甘蔗的的组织培培养中表表现十分分明显。在在外植体体最适宜宜的脱分分化条件件下, 分生能能力强的的细胞大大量增殖殖, 酚酚类的氧氧化会受受到抑制制。在芽芽旺盛增增殖时, 褐变变也被抑抑制。此此外, 培养条条件不适适宜, 如温度度过高或或光照过过强, 均可使使多酚氧氧化酶的的活性提提高, 从而加加速被培培养组织织的褐变变。培养时间过过长接种种后材料料培养时时间过长长, 未未及时转转移, 也会引引起材料料的褐变变, 甚甚至导致致全部死死亡, 这在培培养过程程中是经经常可见见的。、褐变的防防止选择适当的的外植体体和培养养条件： 选择择适当的的外植体体和培养养条件

26、是是克服褐褐变的最最主要的的手段。外外植体应应有较强强的分生生能力, 在最最适宜的的细胞脱脱分化和和再分化化的培养养条件下下, 使使外植体体处于旺旺盛的生生长状态态, 便便可大大大减轻褐褐变。抗氧化剂的的作用：在培养养基中加加入抗坏坏血酸、聚聚乙烯吡吡咯烷酮酮( PPVP)、半胱胱氨酸等等抗氧化化剂, 或用抗抗氧化剂剂进行材材料的预预处理或或预培养养, 可可减轻醌醌类物质质的毒害害。连续转移：对于易易褐变的的材料, 进行行连续转转移, 可以减减轻醌类类物质对对培养物物的毒害害作用。试管苗的增增殖与继继代培养养（一）、加加快试管管苗的繁繁殖速度度1、试管苗苗繁殖类类型试管繁殖类类型共有有五种：微

27、型扦扦插型、丛丛生芽增增殖型、器器官发生生型、胚胚状体发发生型、原原球茎发发生型，一一定要注注意其遗遗传稳定定性, 前三种种途径一一般能保保持遗传传稳定性性。2、试管繁繁殖速率率及计算算统计试管苗苗增殖速速度, 有以苗苗为单位位, 也也有以芽芽或未生生根的小小茎作单单位的, 以原原球茎球球状体或或胚状体体因难以以统计, 则以以瓶为单单位。大大多数以以芽和苗苗作单位位。试管苗理论论上一年年能繁殖殖多少, 可用用下面的的简单公公式计算算:Y = mmXnY = 年年繁殖数数m = 无无菌母株株苗数X = 每每个培养养周期增增殖的倍倍数n = 全全年可增增殖的周周期次数数例如月季每每5 周周转接一一

28、次, 甲品种种每次增增殖3 倍, 乙品种种每次增增殖5 倍, 丙品种种每次增增殖7 倍, 假定一一开始都都是一个个芽, 那么这这三个品品种一年年能繁殖殖多少呢呢? 根根据公式式可知:n =3665d/35dd= 110 .4 , 即每每年可转转接100 次, 那么么这三个个品种年年繁殖率率分别计计算如下下:甲品种Y = 1131 0 = 599 0000 = 5 .91044乙品种Y = 1151 0 = 9 7600 0000 = 9 .7661066丙品种Y = 1171 0 = 2882 0000 0000 = 2 .821088从上可知甲甲品种每每5 周周转接一一次, 一年可可繁殖出出

29、5 万万多苗, 乙品品种每周周期增殖殖5 倍倍, 一一年可得得9000 多万万苗, 而丙品品种每周周期增殖殖7 倍倍, 一一年可繁繁殖出22 亿苗苗来。不过实际值值远比理理论值为为低。因因为实践践中要受受到多种种因素制制约, 困难很很多。但但理论计计算可以以作为一一个计算算产量的的指标, 提供供参考, 有它它的积极极意义。3、提高繁繁殖速度度的方法法不仅试管苗苗的繁殖殖类型不不同, 而且在在试管内内又受到到基因型型、外植植体来源源、年龄龄、部位位、培养养基种类类、附加加成分和和培养环环境等多多种因素素的影响响, 应应通过具具体试验验来摸索索每种植植物最快快最好的的繁殖方方法。1）、改进进培养基

30、基：、不同的植植物材料料需要使使用不同同类型的的培养基基。、糖具有维维持培养养基渗透透压的作作用，在在培养过过程中植植物组织织不断地地从培养养基中吸吸收糖，糖糖浓度降降低，当当糖浓度度不能维维持正常常渗透压压时，材材料要转转移到新新鲜培养养基。培培养基中中的维生生素绝大大部分为为B族维维生素，它它们一各各种辅酶酶的形式式参与植植物代谢谢活动，影影响形态态发生、分分化及试试管苗的的生长，为为防植物物缺乏，一一般均加加入。、植物生长长调节物物质在试试管苗增增殖中期期决定性性作用促进叶芽形形成和生生长的激激素：细细胞分裂裂素抑制制了植物物的顶端端优势，使使得叶芽芽不断分分化和生生长，逐逐渐形成成芽丛

31、，并并促进芽芽丛生长长。大多多植物最最适用量量为1.02.00，一般般用量00.110.0。应应用最多多的是66-BAA,其次次KT和和2ipp，ZTT用的较较少，因因它的价价格太贵贵。对于于微型扦扦插型繁繁殖可不不加细胞胞分裂素素或加00.1以以下也可可。除了了细胞分分裂素以以外，还还可加入入低浓度度的生长长素，以以促进叶叶芽的生生长，但但要防止止愈伤组组织化。常常用的有有NAAA,IBBA,IIAA，浓浓度在00.11.00。在实际操作作中高浓浓度细胞胞分裂素素和低浓浓度生长长素的配配比，既既能提高高腋芽的的增殖速速度，也也能保证证腋芽健健壮生长长。如果果细胞分分裂素浓浓度过高高生长素素浓

32、度过过低，会会形成过过于细密密的嫩芽芽，虽然然提高了了增殖速速度，但但苗多而而弱，降降低了芽芽的质量量。但如如果细胞胞分裂素素过低，生生长素过过高，影影响芽的的增殖速速度，甚甚至有时时没有侧侧芽产生生。B、诱导不不定芽形形成和生生长的激激素：除除现有的的芽之外外, 任任何器官官上的, 通过过器官发发生重新新形成的的芽称为为不定芽芽。促进进外植体体形成不不定芽, 要使使用一定定量的细细胞分裂裂素和生生长素, 一般般浓度不不能过高高。否则则不但使使器官分分化能力力降低, 而且且也使遗遗传性难难以稳定定。诱导外植体体形成不不定芽时时, 一一般使用用细胞分分裂素的的浓度高高于生长长素浓度度的配比比,

33、但但也经常常采用细细胞分裂裂素和生生长素浓浓度的比比值接近近于1 的配比比。C、促进胚胚状体的的形成和和繁殖的的激素：胚状体体途径的的优点是是增殖率率高, 而且同同时具有有胚根和和胚芽, 可免免去生根根。现在在胚状体体发生还还不普遍遍或产生生的胚状状体难以以成株或或成株率率太低, 以及及遗传性性尚不稳稳定, 故仅在在有限植植物中应应用。一一般是在在含有丰丰富还原原氮的培培养基上上, 加加有生长长素, 特别是是2 , 4 - DD 以诱诱导胚状状体的发发生, 然后转转移到降降低浓度度或没有有生长素素的培养养基上使使其成熟熟、萌发发和生长长。培养基中, 还可可加入其其他附加加成分, 如氨氨基酸、水

34、水解乳蛋蛋白( LH ) 3300mmg/ L5500mmg/ L、水水解酪蛋蛋白(CCH) 2000mg/ L5000mg/ L, 以及及腺嘌呤呤(ADDE) 1mgg/ LL800mg/ L 等, 以促进进试管苗苗的生长长。、改善培养养条件:试管苗苗增殖与与培养条条件如温温度、光光照、湿湿度、培培养器皿皿和培养养基的ppH值密密切相关关, 需需要进行行控制, 以促促进繁殖殖。保持试管苗苗的继代代培养试管苗的继继代方法法、液体培养养、固体培养养影响试管苗苗继代培培养的因因素及解解决措施施、驯化现象象：有些些植物在在开始的的继代培培养中需需要添加加生长调调节物质质, 其其后加入入少量或或不必加

35、加入生长长调节物物质就可可以生长长, 此此现象就就叫做“ 驯化化”。、在长期的的继代培培养中, 材料料自身内内部要发发生一系系列的生生理变化化, 除除了前面面讲的“ 驯化化”现象外外, 还还会出现现形态发发生能力力的丧失失。一般认为分分化能力力衰退主主要有三三个因素素:愈伤组织中中含有从从外植体体启动分分裂时就就包括进进来的成成器官中中心（分分生组织织），当当重复继继代则会会逐渐减减少或丧丧失，这这意味着着不能形形成维管管束，只只能保持持无组织织的细胞胞团。形态发生能能力的减减弱和丧丧失也可可能与内内源生长长物质的的减少或或丧失有有关。也可能是细细胞染色色体出现现畸变，数数目增加加或丢失失。影

36、响继代培培养的其其他因素素、植物材料料的影响响 不不同种类类植物，同同种植物物不同品品种，同同一植物物不同器器官或不不同部位位继代繁繁殖能力力也不相相同。一一般是草草本木木本；被被子植物物裸子子植物；年幼植植物老老年植物物；刚分分离植物物已继继代植物物；胚营养体体植物；芽胚胚状体愈伤组组织。、培养基及及培养条条件 培养基基及培养养条件适适当与否否对能否否继代培培养影响响颇大，故故常改变变培养基基和培养养条件来来保持继继代培养养。、继代培养养时间长长短 关于继继代培养养次数对对繁殖率率的影响响的报道道不一。有有的材料料长期继继代可保保持原来来的再生生能力；有的经经过一定定时间继继代后才才有分化化

37、再生能能力；而而有的随随继代时时间加长长而分化化再生能能力降低低。、季节的影影响 植物材材料能否否继代与与季节有有关。一般能达到到每月继继代310倍倍，即可可用于大大量繁殖殖，盲目目追求过过高增殖殖倍数一一是所产产小苗小小而弱，给给生根、移移栽带来来很大困困难，二二是会引引起遗传传性不稳稳定，造造成灾难难性后果果。试管苗的生生根与移移栽试管苗的生生根试管内生根根、根发生过过程 植物离离体培养养根的发发生都来来自不定定根。根根的形成成从形成成上可以以分为两两个阶段段，即形形成根源源基和根根源基的的伸长及及生长。前前一阶段段根源基基的形成成包括第第一次、第第二次细细胞横分分裂和第第三次细细胞纵分分

38、裂，细细胞横分分裂能够够被生长长素促进进。根源源基的启启动和形形成约历历时488h，后后一阶段段为细胞胞快速伸伸长阶段段，大约约需24448hh。根源源基的形形成和生生长素有有关，根根源基的的伸长可可以在没没有外源源生长素素下实现现。、影响试管管内生根根的因素素 、植物材料料 不不同植物物、不同同基因型型、同一一植株不不同部位位和不同同年龄对对分化根根都有决决定性因因素。若若试管里里不生根根不要完完全从培培养中去去找原因因，也应应在取材材时考虑虑。不同同植物的的一般生生根规律律是：木木本比草草本难，成成年树比比幼年树树难，乔乔木比灌灌木难。、基本培养养基 大多数数使用低低浓度的的MS培养养基，

39、其其中不少少使用11/2MMS或11/3MMS培养养基。大大量元素素中有人人认为NNH4+多可能能不利于于发根，生生根需要要P和K元素，但但不宜太太多；而而Ca2+多数报报道有利利于根的的形成于于生长。微微量元素素对生根根有利的的是B和Fe。生生根通常常用1%3%的的蔗糖。植物生长调调节剂 据报报道单用用一种生生长素的的占511.55%，生生长素加加激动素素占200.1%。a、愈愈伤组织织分化根根时使用用NAAA最多，浓浓度以11.02.00为多。使使用IAAA+激激动素浓浓度范围围以1.04.00和0.010.002居多多。b、而而胚轴、茎茎段、插插枝、花花梗等分分化根时时，使用用IBAA居

40、首位位，浓度度以1.01为为多。可可见生根根培养多多数使用用生长素素，大多多以IAAA、IIBA、NNAA单单独用或或配合使使用，或或与低浓浓度激动动素配合合使用。NNAA与与细胞分分裂素配配合时摩摩尔比在在（20030）：1为好好。一般般赤霉素素、细胞胞分裂素素、乙烯烯通常不不利于发发根，如如与生长长素配合合，一般般浓度宜宜低于生生长素，AABA可可能有助助于发根根，植物物生长延延缓剂多多效唑（MMET）对对不定根根的形成成也有良良好作用用，使用用浓度00.14.00。、使用方法法 将将生根材材料先在在一定浓浓度植物物生长调调节剂中中浸泡或或培养一一段时间间，然后后转入无无植物生生长调节节剂

41、培养养基中培培养，能能显著提提高生根根率。、其他物质质 间间苯三酚酚、脯氨氨酸、核核黄素、活活性炭等等等。、继代培养养 新新梢生根根能力随随继代时时间增长长而能力力增加，植植物在培培养初期期不易生生根。从从试管苗苗长成的的植株上上去枝条条比在一一般植株株上取的的更易生生根。、光照强度度和光照照时间对对生根的的影响十十分复杂杂，结果果不一。、pH值 一般般在5.06.00。、温度 16C 25C。试管外生根根有些植物种种类在试试管内难难以生根根，或有有根但与与茎维管管束不相相通，或或根与茎茎联系差差，或有有根无根根毛，或或吸收功功能极弱弱不易成成活，此此时可采采用试管管外生根根的方法法，把生生根

42、和驯驯化过程程联系起起来，即即可大幅幅度降低低成本，又又可提高高移栽成成活率。试试管外生生根有三三种方法法：、在试管内内诱导根根源基再再移栽 、在生根小小室进行行生根和和炼苗 做一一个生根根小室，不不用琼脂脂和蔗糖糖，而用用透气又又保湿的的基质如如泥炭、蛭蛭石、珍珍珠岩、苔苔藓等，并并要控制制温度、光光照、采采用人工工喷雾，雾雾滴要细细。、盆插和瓶瓶插生根根法 用罐头头瓶或盆盆内装有有泥炭或或腐殖土土与细沙沙，每瓶瓶插入220株或或30株株无根苗苗，插入入深度为为0.331.22cm,加入11/22MS+1.005.00IBAA或IAAA生根根液,，在在一定温温度、光光照及湿湿度下培培养，容容易生根