王淼姜黄素磷脂复合物的制备药效学评价及代谢动力学研究课件

1、姜黄素磷脂复合物的制备、药效评价及在大鼠体内药代动力学研究 Kuntal Maiti， Kakali Mukherjee ， Arunava Gantait，Bishnu Pada Saha， Pulok K. MukherjeeJadavpur大学 天然产物化学学院制药工程系 王淼 Shenyang Argiculture university （译） 1前言2材料和方法3实验结果4讨论 Thank You！ December 22th 2010 1前言1姜黄素简介2磷脂复合物的研究2材料和方法 2.1 材料 2.2 姜黄素磷脂复合物的制备 2.3 复合物中姜黄素含量测定 2.4 复合物的显

2、微特征 2.5 复合物的差示扫描热特征 2.6 高效薄层色谱法研究 2.7 溶解性能研究 2.8 抗氧化性活性测定 2.9 大鼠血清姜黄素含量的测定2.10 药动学参数研究2.11 统计学分析 2.9 大鼠血清姜黄素含量的测定2.9.1 血清中姜黄素提取和样品的预处理2.9.2 标准溶液的制备2.9.3 有效提取含量的测定3实验结果3.1 复合物中姜黄素含量3.2 复合物的显微观察结果3.3 差示扫描热量吸收图谱3.4 高效薄层色谱的研究3.5 抗氧化酶的活性3.6 姜黄素在血清的浓度变化3.7 药动学参数 磷脂可以增强一些口服难吸收的药物的疗效。水飞蓟宾就是其中一种口服生物利用度极低的药物分

3、子。水飞蓟宾磷脂复合物，不仅增加了口服生物利用度，还提高了药物疗效。实验观察到水飞蓟宾磷脂复合物比单纯水飞蓟宾具有更好的护肝作用和抗氧化作用。槲皮素磷脂复合物对四氯化碳造成的大鼠肝脏急性损伤的治疗效果优于槲皮素。 2.1材料磷脂，氢化大豆磷脂酰胆碱（HSPC），购买自德国路德维希港脂质化工厂；姜黄素购买自美国Sigma Chemical；EDTA，丙二酰硫脲，三氯乙酸，羧甲基纤维素钠，十二烷基硫酸钠，正己烷和其他试剂购买自印度Mumbai Loba Chemie；谷胱甘肽，谷胱甘肽还原酶，牛血清白蛋白，三羟基氨基甲烷缓冲液，四硝唑基蓝，5,5-二硫代双(2-硝基苯甲酸)，吩嗪N-甲硫酸盐，正辛

4、醇购买自印度Mumbai SRL Chemicals 。 2.2姜黄素磷脂复合物的制备 姜黄素和HSPC按摩尔比为1：1称取，加到100毫升的圆底烧瓶中，加入20ml二氯甲烷，在不超过60的条件下搅拌2小时。将反应后的溶液蒸干，加入10毫升正己烷继续搅拌至姜黄素磷脂复合物析出，过滤，取沉淀减压真空干燥，除去残留的溶剂。反应得到的姜黄素磷脂复合物（产率88%）放置于充氮气的棕色瓶中，室温保存。 2.4 复合物的显微特征 采用Leica （ type DC 300F）显微镜 ，CH-9435 Heerbrugg 等来检测复合物的显微特征。复合物用蒸馏水分散后，取样放在载玻片上，盖上盖玻片进行观察。

5、样品的放大倍数为400倍。2.5 复合物的差示扫描热特征 将样品装在密封的铝制薄管中，在充满氮气的反应室内，温度从0以每分钟10的速度上升至300。姜黄素、磷脂、姜黄素磷脂复合物以及姜黄素和磷脂的物理混合物的能量吸收跳跃以及差示扫描图谱采用Mettler DSC 30S 系统进行分析比较。 2.7 溶解性能研究为了测定室温下姜黄素的溶解特性，分别去等量的姜黄素磷脂复合物和磷脂与姜黄素的物理混合物进行试验，取样品加入到5mL含水和正辛醇的溶液中。混合液体振荡24小时，然后5000转每分钟离心10分钟。取上清液，过滤，取续滤液1毫升用甲醇定容至10毫升，进样20微升，采用高效液相色谱法测定其含量，

6、检测波长为425nm。2.8.1 实验动物雄性大白鼠（Wistar strain品系），体重180200克。大白鼠78只一组，环境温度2025，相对湿度45%55%，白昼各12小时。大白鼠自由采食和饮水。实验按照实验动物管理规范（CPCSEA）的相关规定进行。 2.8.2 剂量的确定大白鼠分成六组，每组六只。第一组每日灌服1%（v/v）的吐温20溶液，第二组只在第七天灌服单剂量的四氯化碳和橄榄油的混合物，三四组则每日用含吐温20的姜黄素的混悬液处理，剂量分别为100和200mg/kg，五六组则每日用磷脂复合物处理，剂量分别为100和200mg/kg（按姜黄素计算），其余条件不变，正常饲养一周。

7、第七天，所有对动物都灌服单剂量的四氯化碳和橄榄油的混合物。 2.8.3 酶活力的测定 所有动物在第八天用乙醚麻醉后处死。动物处死以后立即取出肝脏，搅碎，供生化测定用。肝脏用冰块预冷的生理盐水冲洗，然后用pH7.4的Tris-HCl缓冲溶液制备匀浆。匀浆离心，取上清液，用之前报道的一些方法来测定谷胱甘肽还原酶，谷胱甘肽过氧化酶，谷胱甘肽-S-转移酶，谷胱甘肽还原酶类，超氧化物岐化酶，过氧化氢酶等。硫代巴比妥酸的反应活性测定采用Ohkawa等人研究的方法。蛋白质含量测定用牛血清白蛋白为标准。 2.9.1 血清中姜黄素的提取和样品的预处理雄性白色Wistar品系大鼠，体重150200克，分成两组，每

8、组六只。其中一组灌服1.0g/kg体重的姜黄素，另一组灌服1.0g/kg体重的姜黄素磷脂复合物（以姜黄素计）。然后用乙醚麻醉大鼠，从颈静脉每隔一定时间采取血样。血样在离心管中室温放置1小时凝血，然后3000转每分钟离心10分钟，分离得到血清，血清在-20保存备用。 姜黄素的浓度采用高效液相色谱法测定。流动相为甲醇2%乙酸：乙腈比列为5：30：65，流速控制1.0ml/min，检测波长425nm。取1mL血清，在其恢复至室温前加入到10毫升的容量瓶中，加入5毫升甲醇。水浴温度7580，强烈振摇溶液2530min。然后取出溶液用甲醇定容至10毫升，转移至15毫升离心管中，5000rpm，10min

9、，分离的上清液。每次进样量为20微升。 2.9.2 标准溶液的制备 取10mg姜黄素标准品用甲醇溶解并定容至10毫升。取0.1毫升溶液，用甲醇稀释为0.1ppm。2.10 药动学参数研究 姜黄素磷脂复合物的主要药动学参数研究以姜黄素的药动学研究参照，用WINNONLIN-4.1对数据进行处理。最大血清浓度和达到最大浓度所要的时间都可以从浓度-时间曲线上获得。药时曲线下面积(AUC0-tn and AUC0-t)，清除半衰期(t1/2el)，消除速率常数(Kel)，清除率（Cl），表观分布容积(Vd)等都可以测得。相对生物利用度(F)也可以通过下面的公式计算得到：2.11 统计学分析数据均采用平

10、均值标准误差。以抗氧化活性为例，其数据的分析采用的是方差分析法和Dunnetts test（丹内特测验法）。而血清药物浓度的研究采用的是Students “t” 检验法。P值0.05表示显著差异。 3.2 复合物的显微观察结果差示扫描热量法是一种快速简便可行的检测方法，尤其在检测药物与赋形剂的相互作用时可以提供大量信息。在DSC分析中，可以通过观测吸热峰的消失，出现新的吸热峰，吸热峰的形状或峰高发生变化，峰值温度、熔点、相关区域焓的变化都可以作为结果判定的依据。图2中反映了各个组分的DSC热解图线。A为姜黄素，B为磷脂，C为姜黄素磷脂复合物，D为姜黄素和磷脂的物理混合物。3.3 差示扫描热量吸

11、收图谱3.4 高效薄层色谱的研究3.5 抗氧化酶的活性3.5.1 肝脏谷胱甘肽酶系统 3.5.2 TBARS指数3.5.3 SOD活性 3.5.4 CAT指数3.5.1 肝脏谷胱甘肽酶系统3.5.2 TBARS指数3.5.3 SOD活性 3.5.4 CAT指数3.6 姜黄素在血清的浓度变化3.7 药动学参数 4 讨论四氯化碳可以造成肝细胞损伤，表现为肝小叶中心坏死，肝脏的各种酶系统受到损伤。四氯化碳造成肝脏毒性是因为细胞色素P450酶代谢四氯化碳产生三氯甲基根，三氯甲基根可以引发一系列级联的自由及反应，加速过氧脂质化并使肝脏大部分酶活性降低。研究发现很多有抗氧化功能的物质形成复合物以后可以有效

12、对抗四氯化碳引发的肝损伤。姜黄素可以促进胆汁酸的产生和分泌。它还可以加速胆汁的排泄和脂肪代谢物的排泄，从而排泄胆汁中过多的胆固醇。可能是肝脏加速胆汁的排泄从而使四氯化碳的毒性代谢产物也随胆汁排除。姜黄素也是一种良好的自由基清除剂，可以提高肝脏清除自由基的能力，从而起到保护肝脏的作用 脂质化的固体药物口服给药后其生物利用度是非常低的。引起这种结果的原因是多方面的，其中最显著的一个原因就是由药物在胃肠道中溶解不完全或溶解缓慢所引起的吸收度差。此种情况，要提高生物利用度就可以通过改进给药系统而实现。改进后的给药系统可以提高药物溶出速率或者增加其在肠胃液中的溶解度。磷脂在这种给药系统中发挥着重要的作用。脂质化在增加药物溶解度方面有着许多的优点，并正在尝试把它作为一种给药系统。在现阶段的研究中，我们采用了一种简单可重复的实验方法来制备姜黄素磷脂复合物。其理化性质的研究结果表明姜黄素和磷脂形成了复合物，增加了药物的水溶性和正辛醇中的溶解性。新形成的复合物其抗氧化效果也明显优于单纯的姜黄素。姜黄素仅在200mg/kg时可以抵抗四氯化碳对肝脏造成的损伤。