遗传工程简介精要

1、遗传工程染色体工 程基因工程细胞工程第三节 遗传工程简介p75 genetic engineering1通过细胞融合cell fusion即细胞杂交cell hybridization来探索遗传变化或通过细胞器的转移来研究其功能。细胞工程cellular engineering2染色体工程chromosomal engineering即分离提取某一染色体或某一段染色体，然后将其转移至另一细胞来分析其遗传效应。3是建立在分子遗传学理论基础之上，以控制性状遗传的基因为操作对象，按着预先的构想，在严格控制条件下完成基因转移，达到改造遗传性目的的过程。基因工程genetic engineering4综

2、上，所谓遗传工程，即根据遗传学的原理，采用类似工程设计的方法，对生物遗传物质进行有计划的技术操作，从而达到定向改造生物遗传组成，使其获得新的遗传性状，这一过程称为遗传工程。5*一、细胞工程 细胞工程主要技术和研究领域包括： (一)、细胞、原生质体植株再生(二)、植物原生质体作为基因工程的受体(三)、细胞、原生质体融合p75四细胞核移植五细胞器移植6一、动物细胞培养的环境要求 1、温度2、pH3、溶氧及气体环境4、渗透压7二、动物细胞的营养需求1、天然培养基其优点是营养成分丰富、培养效果好；缺点是成分复杂、个体差异大、来源有限。 天然培养基的种类主要包括生物性体液如血清、组织浸出液如胚胎浸出液、

3、凝固剂如血浆、水解乳蛋白等。82、合成培养基合成培养基是根据天然培养基的成分，用化学物质对细胞体内生存环境中物质在体外人工条件的模拟，经过反复试验筛选、强化和重新组合后形成的培养基。 合成培养基的优点：既能给细胞提供一个近似于体内的生存环境，又便于控制和提供标准化体外生存环境。 合成培养基的主要成分：氨基酸、维生素、糖类、无机离子和其它辅助成分。二、动物细胞的营养需求9三、动物细胞工程的主要技术及其实践意义一单克隆抗体技术在现代医学中的应用二胚胎移植和核移植技术在畜牧业中的应用三动物细胞大量培养生产次生产物四动物克隆技术的应用潜力10*二、染色体工程染色体工程是物种间遗传转移的最传统的方式，也

4、是目前广泛进入生产应用的遗传工程。利用染色体替换来改变生物遗传特性，如利用染色体的易位、缺体、三体等方法，获得新的染色体组合。p7711(四)、 染色体工程中的现代技术一多倍体 二双二倍体(三)、 削减、添加、代换、易位12基因决定性状一青霉菌能产生对人类有用的抗生素青霉素 13基因决定性状二豆科植物的根瘤能够固定空气中的氮14基因决定性状三家蚕能够吐出蚕丝为人类利用15定向基因改造设想 设想一能否让禾本科的植物也能够固定空气中的氮？能否让细菌“吐出蚕丝？设想二能否让微生物产生出人的胰岛素、干扰素等珍贵的药物？设想三经过多年的努力，科学家于20世纪70年代创立了可以定向改造生物的新技术基因工程

5、。16返回把大鼠生长因子转入小鼠得到巨大型的转基因小鼠。17基因工程简介在各种酶的作用下，将目的基因的DNA分子与载体DNA分子相连接，形成重组的DNA分子，以一定的方式导入原无该类分子的宿主细胞，并使宿主生物变为自然界原来没有并能连续传代的新生物。18要点： 供体、载体、受体基因工程分狭义上游：重组、克隆、表达的设计和构建。广义下游：表达工程菌的发酵培养和产物的纯化。目的：DNA扩增，外源基因表达产物，表达调控，改造生物遗传特性等。基因工程简介19基因工程概念p78基因工程：在生物体外，通过对DNA分子进行人工“剪切和“拼接，对生物的基因进行改造和重新组合，然后导入受体细胞进行无性繁殖，使重

6、组基因在受体细胞内表达，产生出所需要的基因产物。基因工程的别名基因拼接技术或DNA重组技术操作环境生物体外操作对象基 因操作水平DNA分子水平基本过程剪切拼接导入表达结果人类需要的基因产物20基因工程过程示意图从细胞中分离出DNA限制酶截取DNA片断分离大肠杆菌中的质粒 DNA重组用重组质粒转化大肠杆菌培养大肠杆菌克隆大量基因21基因工程操作的工具将目的基因片断从人体细胞内提取，需要基因的剪刀限制性内切酶。将目的基因与运载体DNA连接，需要基因的针线DNA连接酶。将目的基因运入大肠杆菌，需要基因的运输工具运载体。22限制性内切酶分布：主要在微生物中。特点：特异性，即识别特定核苷酸序列， 切割特

7、定切点。结果：产生黏性未端碱基互补配对。举例：大肠杆菌的一种限制酶能识别GAATTC序列，并在G和A之间切开。 一种限制酶只能识别一种特定的核苷酸序列，并在特定的切割点上将DNA 分子切断。目前已发现的限制酶有200多种。23限制性内切酶作用过程点击播放24DNA连接酶连接酶的作用：将互补配对的两个黏性末端连接起来，使之成为一个完整的DNA分子。连接的部位：磷酸二酯键，不是氢键。问题用DNA连接酶连接两个相同的黏性未端要连接几个磷酸二酯键？25DNA连接酶的作用过程点击播放26运载体p79作用：将外源基因送入受体细胞。条件：能在宿主细胞内复制并稳定地保存。具有多个限制酶切点。具有某些标记基因种

8、类：质粒、噬菌体和动植物病毒。要让一个从甲生物细胞内取出来的基因在乙生物体内进行表达，首先得将这个基因送到乙生物的细胞内去。能将外源基因送入细胞的工具就是运载体。27质 粒返回28目的基因与质粒的连接返回292噬菌体： 303p79病毒： 常用的为SV40，通过感染方式将其DNA送入哺乳动物细胞中进行增殖。目前应用相对较少。 31基因操作的基本步骤提取目的基因目的基因与运载体结合将目的基因导入受体细胞目的基因的检测和表达32提取目的基因将需要的基因从供体生物的细胞内提取出来。取 出DNA用限制酶切断DNA 目前被较广泛提取使用的目的基因有：苏云金杆菌抗虫基因、人胰岛素基因、人干扰素基因、种子贮

9、藏蛋白基因、植物抗病基因等。33提取目的基因的方法一p79 直接分离基因鸟枪法 用限制酶切成许多片断34提取目的基因的方法二 人工基因合成法逆转录法：以信使RNA为模板，在逆转录酶的作用下将脱氧核苷酸合成合成DNA(基因)。直接合成法：根据蛋白质的氨基酸顺序推算出信使RNA核苷酸顺序，再据此推算出基因DNA的脱氧核苷酸顺序。用游离脱氧核苷酸直接合成相应的基因。DNA合成仪PCR扩增仪35一基因的分离各种生物中所含的基因很多。例如，最简单的DNA病毒也有近几十年基因，原核细胞有几千个基因，真核细胞那么有上万个基因。这些不同的基因，在化学结构上都是由4种核苷酸组成，它们间性质极为相似，这样增加了基

10、因分离和提纯的困难。目前，分离基因的方法有下述几种：1.物理化学法 2.化学合成法3.酶促合成法36目的基因与运载体结合用与提取目的基因相同的限制酶切割质粒使之出现一个切口，将目的基因插入切口处，让目的基因的黏性末端与切口上的黏性末端互补配对后，在连拉酶的作用下连接形成重组DNA分子。提取质粒并用限制酶切割用连接酶将目的基因和质粒连接37将目的基因导入受体细胞并扩增基因工程中常用的受体细胞有大肠杆菌、枯草杆菌、土壤农杆菌和动植物细胞等。导入受体细胞常用的方法是借鉴细菌或者病毒侵染细胞的途径。通常还要对一些受体细胞进行增大通透性的处理。目的基因可以随着受体细胞进行快速的繁殖，在很短的时间内获得大

11、量的基因。将目的基因导入受体细胞将受体细胞进行扩增38目的基因的检测和表达一 前三步的处理十分繁锁，为保证目的基因得到有效利用，通常用大量的受体细胞来接受不多的目的基因。这样，处理的受体细胞中真正摄入了目的基因的很少，必须将它从中检测出来。 细菌的检测，将每个受体细胞单独培养形成菌落，检测菌落中是否有目的基因的表达产物。淘汰无表达产物的菌落，保留有表达产物的进一步培养、研究。无表达产物无表达产物有表达产物无表达产物39目的基因的检测和表达二多细胞生物的检测，将每个受体细胞单独培养并诱导发育成完整个体，检测这些个体是否摄入目的基因，摄入的基因是否表达是否表现出相应的性状。淘汰无变化的个体，保留有

12、相应变化的个体进一步培养、研究。例：用棉铃饲喂棉铃虫，如虫吃后不出现中毒症状，说明未摄入目的基因或摄入目的基因未表达。如虫吃后中毒死亡，那么说明摄入了抗虫基因并得到表达。40转基因动物及其在医药行业中的应用SeminarI41什么是转基因动物转基因动物是指用实验导入的方法将外源基因在染色体基因内稳定整合并能稳定表达的一类动物。包括基因敲除的动物42外源基因导入的时机初期生殖细胞的改造；将DNA或基因结构用微注射技 术注射到受精卵中；将改造的细胞包括胚胎干细胞 融合到后期胚胎。精子卵子受精卵胚胎干细胞43转基因的技术手段 DNA显微注射核转移技术克隆胚胎干细胞技术逆转录病毒介导的基因转移RNA干

13、扰精子作为载体44一、DNA显微注射技术 2003 John Wiley and Sons Publishers优缺点：1.可靠性高、重复性好2.对于小鼠来说，产生转基因动物的效率比较高3.导入DNA片段的大小和类型不受限制4.转基因在代与代之间传递的稳定性好5.整合位点的随意性可能对转基因表达造成影响6.可能会出现不希望的插入突变7.开发装置和技术的花费大时间长1980 PNAS 77,7380-7384转基因的技术手段45二、核移植技术优点：转基因效率显著超过显微注射可以方便的建立生产畜群可以预测基因表达水平可以使用定点整合目标基因的技术方法处理胚胎数移植数生产牛犊数转基因牛数显微注射11

14、5411541292克隆法 276 33 33显微法和克隆法效率比较1997 Nature 385, 81081346三、胚胎干细胞技术(1993) Nature 365, 878947四、逆转录病毒介导的基因转染缺点：低拷贝数需要逆转录病毒插入DNA大小有限可能产生不希望的重组高频的镶嵌现象逆转录病毒的序列可能干扰转基因表达(1985) Proc. Natl. Acad. Sci. U. S. A. 82, 6148615248五、RNA干扰技术(1998) Nature 391, 80681149六、精子介导法将外源DNA与精子一起孵育，精子可捕获外源DNA，并通过受精过程将外源DNA导入

15、受精卵。此法不仅可免去复杂而昂贵的设备，且可省去不少繁杂的操作和条件准备。但该法有些结果不能重复。Lavitrano, M. et al. (1989) Sperm cells as vectors for introducing foreign DNA into eggs: genetic transformation of mice. Cell 57, 71772350小结方法显微注射核移植胚胎干细胞逆转录病毒基因敲除精子介导优点外源基因整合效率较高，不需要载体，目的基因的长度可达100Kb转基因效率高；预测基因表达水平；可以使用定点整合技术外源DNA的整合率高； 整合在生殖细胞中的比例也

16、很高。 可在整合点整合转移基因的单个拷贝； 该方法简单、方便 缺点精密仪器， 技术操作较难，易造成宿主动物基因组的插入突变供体细胞易衰老ES细胞株不易建立，长期培养后出现分化现象；生产的转基因动物都是嵌合体 插入的基因有大小限度；嵌合性很高；外源DNA 在动物各种组织中的分布不均 应用具有一定局限性有些结果不能重复 51转基因动物在医药行业中的应用人类疾病造模药物产品的生产异种移植52人类疾病造模动物模型对疾病产生机理和治疗是必不可少的工具利用转基因动物可以创造出多种动物模型转基因动物用于发病机理研究的例子：AD对AD患者死亡后脑部解剖发现脑部存积了一种淀粉状蛋白的蛋白质将人类淀粉状蛋白的基因转到大鼠体内使其发病，再清除淀粉状蛋白，发现确实能够减慢甚至停止病情。 (1991) Science 253, 323325(2004) Mol. Psychiatry 9, 66468353药物产品的生产主要通过乳腺生产动物乳腺生物反应器，少数通过肾脏和膀胱。1999年，只有三种产品进入临床实验；到2004年，已经有40多种进入临床实验或即将进入市场。2005 DDT