《药物分析》chapter4课件

1、第四章 药物定量分析与分析方法验证药物定量分析基本要求 一、掌握定量分析方法验证的效能指标二、熟悉定量分析样品的前处理方法三、了解定量分析样品的前处理方法的 进展及在药物分析中的应用第一节 定量分析样品的前处理方法一、概述1.为什么要对定量分析的样品进行前处理？卤素有机药物 R-X （F，Cl, Br, I） 金属有机药物 R-O-M（有机酸 含金属有 或酚的金属盐结合不牢固）机药物 有机金属药物 R-M（结合牢固）2.常用的处理方法 不经有机破坏的分析方法 经有机破坏的分析方法二、不经有机破坏的分析方法（一）直接测定法例如：富马酸亚铁 溶于热稀矿酸，采用铈量法，邻二氮菲作指示剂（二）经水解后

2、测定法 1. 直接回流后测定法 例如：三氯叔丁醇的含量测定 Cl3-C(CH3)2-OH + 4NaOH (CH3)2CO +3NaCl + HCOONa +2H2O NaCl + AgNO3 AgCl + NaNO3 AgNO3 + NH4SCN AgSCN + NH4NO3 2. 用硫酸水解后测定法 例如：硬脂酸镁的含量测定 Mg(C17H35COO)2 + H2SO4 MgSO4 + 2C17H35COOH H2SO4 + 2NaOH Na2SO4 + 2H2O 3.利用药物中可游离的金属离子的氧化性测定含量（1）含锑药物 例如：葡萄糖酸锑的含量测定 （2）含铁药物 Sb5+ + 2KI

3、 Sb3+ + 2K+ + I2 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6 2Fe3+ + 2KI 2Fe2+ + 2K+ + I2 I2 + 2Na2S2O3 2NaI + Na2S4O6三、经有机破坏的分析方法药物分析中常用的有机破坏的方法有 湿法破坏 干法破坏 HNO3-HClO4法 (一)湿法破坏 HNO3-H2SO4法 H2SO4-硫酸盐法 HNO3- H2SO4- HClO4法； H2SO4-H2O2； H2SO4-KMnO4(二)干法破坏 包括：高温炽灼法、氧瓶燃烧法(1)高温炽灼法 主要适用含卤素药物的的鉴别亦可用于含磷药物的定量测定和药物中砷盐的检查 可以根据

4、需要加入碳酸钠、硝酸镁、氢氧化钙、氧化锌等辅助灰化(2)氧燃瓶燃烧法(oxygen flask combustion method)1.仪器装置 500ml, 1000ml, 2000ml磨口、硬质玻璃锥形瓶2.称样 固体样；液体样要求详见P853.吸收液的选择 依据待测元素种类与分析方法多数是H2O或H2O-NaOH；少数为H2O-NaOH-H2O2.例：含F药物 茜素氟蓝比色法 H2O 含Cl药物 银量法 H2O-NaOH 含Br药物 H2O-NaOH-SO2(aq) 含I药物 H2O-NaOH-SO2(aq) 含S药物 H2O-H2O2 含P药物 H2O 含Se药物 H2O-HNO3第二

5、节 定量分析方法特点药品的含量测定评价药品质量优劣的重要手段 包括：容量分析法 光谱分析法 色谱分析法 一、容量分析法 由已知浓度的滴定液（标准液）滴加至被测药物的溶液中，直至滴定液与被测药物反应完全（指示剂），由化学计量关系计算被测药物的含量。（一）容量分析法的特点 操作简单、快速；比较准确（RSD0.2%）；仪器普通易得。 选择性差，适用于含量较高的试样，主要测化学原料药3. 含量的计算（1）直接滴定法 D% = (V F T)/W 100% F = 实际标定摩尔浓度/规定摩尔浓度 F- 浓度校正因数（2）间接滴定法（生成物滴定法；剩余量滴定法）a.生成物滴定法 被测药物 + A P 用滴

6、定液滴定生成P D% = （V F T）/W 100%b.剩余量滴定法 被测药物 + A(过量） P 用滴定液滴定剩余A 空白校正： D% = （VO VB) F T/W 100%二、光谱分析法（一）紫外-可见分光光度法（200nm760nm)灵敏度高，可达10-4g/ml 10-7g/ml 1. 特点 准确度高，SRD（%）为2% 5% 仪器价格低廉，操作简单，易普及，应用范 围广。2. 朗伯-比耳定律 A = ECL E1%1cm = 10/M3. 仪器校正和检定波长校正用汞灯中较强谱线（P91)或用仪器中氘灯的486.02nm与656.10nm进行校正。吸收度的检定：用K2CrO7(60

7、mg)+0.005mol/L H2SO4液至1000ml波长(nm) 235(最小) 257(最大) 313(最小) 350(最大)E1%1cm 124.5 144.0 48.62 106.6杂散光检查： 试剂 浓度(g/ml) 测定波长 透光率(%) NaI 1.00 220nm 0.8 NaNO2 5.00 340nm 0.84. 对溶剂的要求 220240nm 241250nm 251300nm 300nm以上溶剂+ 0.41 0.20 0.10 0.05吸收池A5. 测定方法 吸收峰波长应在该品种项下规定的波长2nm 内，并以吸光度最大的波长作为测定波长； 要求供试品溶液的A应在0.3

8、0.7之间； 仪器狭缝波带宽度应小于供试品吸收带半宽度的1/10； 扣除空白读数。 1. 对照品比较法：Cx=(Ax/AR)CR 原料药：含量%=（CxD）/W100 % 固体制剂： 标示量%=（CxDw）/(WB)100 % 液体制剂： 标示量%=（CxDv）/(VB)100 %常用方法（二）荧光分光光度法 灵敏度高，可达10-10g/ml10-12g/ml 在低浓度进行测定，防止F与C不成正比 及自熄灭作用 1、特点 用基准物溶液校正仪器灵敏度，防止样品 液荧光衰减 灵敏度高，但干扰因素多。 制备荧光衍生物，可提高其灵敏度和选 择性。 用样品量少，操作简单，方法快速，应 用范围较广。2、荧

9、光分析仪 有二个单色光器激发单色光器与发射单色光 器；且激发光源、样品池和检测器成直角。3、含量测定 常用的方法对照品比较法: Cx = (Rx-Rxb)/(Rr-Rrb) Cr (Rx-Rxb)/(Rr-Rrb)在0.50-2.0之间 Ch.P收载地高辛片、利血平片、洋地黄毒苷片。 内标法加校正因子测定供试品 中主成分含量3、测定方法 外标法测定供试品中主成分含量 （二）GC法1.对GC仪器一般要求 载气为氮气；色谱柱为填充或毛细管柱 色谱柱的理论板数：n = 5.54(tR /Wh/2)22.系统性试验分离度：R =2（tR1tR2)/(W1 +W2); 要大于1.5拖尾因子：T =W0.

10、05h/2d1 应在0.91.05 内标法加校正因子测定供试品 3.测定方法 中主成分含量 外标法测定供试品中主成分含量 标准加入法 第三节 药品质量标准分析方法验证一、准确度 是指用该方法测定结果与真实值接近的程度，用回收率表示（一）含量测定方法的准确度1.原料药 可用已知纯度对照品或样品进行测 定；或与已建准确 度的另一方法测定的结果 进行比较。2.制剂 要考察辅料对回收率的影响。采用在空 白辅料中加入原料对照品的方法作回收率试 验，然后计算RSD。 （二）杂质定量测定方法 色谱法 标准加入法（三）数据要求 回收率% =（测定平均值-空白值）/加入量 100% 要求制备高、中、低三浓度的样

11、品，各测定3次。应报告已知加入量的回收率，或测定结果平均值与真实值之差及其可信限。二、精密度 是指在规定的测试条件下，同一个均匀样品，经多次测定结果之间的接近程度（一）精密度表示方法 1. 偏差(deviation , d) d = 测得值-平均值=Xi-X 2. 标准偏差（standard deviation, SD或S） S =(Xi X)2/(n-1)1/2 3. 相对标准差(relative standard deviation, RSD)也称变异系数 (coefficient of variation, CV) RSD=标准偏差/平均值100%=S/X 100%（二）验证内容 1.重

12、复性 在相同条件下,由一个分析人员测定所得结果的精密度. 2.中间精密度 在同一个实验室，不同时间由不同分析人员用不同设备测定结果的精密度。 3.重现性 在不同实验室由不同分析人员测定结果的精密度。（三）数据要求 应报告标准偏差（S或SD）、相对标准偏差（RSD）和可信限。三、专属性 是指在其他成分(如杂质、降解产物、辅料等)可能存在下，采用的方法能准确测定出被测物的特性。鉴别反应、杂质检查、含量测定方法，均应考察其专属性。（一）鉴别反应 应能与其它共存的物质或相似化合物区分，不含被测组分的样品均应呈现负反应。（二）含量测定和杂质测定 色谱法和其他分离法，应附代表性的图谱，以说明专属性。图中应

13、注明各组分的位置，色谱法中分离度应符合要求。在能获得杂质的情况下，可加到试样中，考察对结果的干扰。在杂质和降解物不能获得的情况下，可用以验证方法和药典方法进行对照；也可用对试样加速破坏的方法，比较两种方法。四、检测限（limit of detection,LOD）是指试样中被测物能被检测出的最低浓度或量，是限度检验指标。它无需测定，只要指出高于或低于该规定的浓度或量即可。（一）常用的方法 1.非仪器分析目视法 用已知浓度被测物，目试出能被可靠地检测出的最低浓度或量。 2.信噪比法 可用已知的低浓度样品测出的信号与空白样品测出的信号进行比较，计算出能被可靠检测出的最低浓度或量。（二）数据要求 应

14、附测试图，说明测试过程和检测限结果。 五、定量限（limit of quantitation, LOQ) 是指样品中被测物能被定量测定的最低量，其测定结果应具一定准确度和精密度。杂质和降解产物进行定量测定时，要求LOQ.常用信噪比法确定定量限，一般以S/N=10时相应的浓度进行 测定。六、线性 是指在设定的范围内，测试结果与试样中被测物浓度直接呈正比关系的程度。UV法：首先制备一个标准系列， 浓度点n =5; A =0.30.7 建立回归方程C = aA + b; r0.9999。HPLC法：制备一个标准系列，浓度点n =57; 以C对h或A或与内标物的峰面积之比， 建立回归方程r0.9999

15、。七、范围 是指达到一定精密度、准确度和线性、测试方法适用的高低限度或量的区间。 原料药和制剂含量测定：范围应为测试浓度的80%-120%。 制剂含量均匀度检查：范围应为测试浓度的70%-130%。 溶出度或释放度中的溶出量测定：范围应为限度的20%。八、耐用性 是指在测定条件下有效的变动时，测定结果不受影响的承受程度。典型的变动因素有：被溶液的稳定性、样品提取次数、时间等。 HPLC法变动因素有：流动相组成与pH，色谱柱，柱温，流速等。 GC法变动因素有：色谱柱，固定相，担体、柱温、进样口和检测器温度等。 分析方法效能指标的具体应用： 1.非定量分析方法：只要求专属性、检测限、耐用性。 2.定量分析方法：除了检测限、定量限外，其余六项均要求。 3.微量定量分