F04核酸化学s课件

1、核酸化学- 概述- 核酸的结构- 核酸性质及研究技术1 核酸 - 遗传信息载体- 元素组成特点 - 含磷高 (10%)- 基本分类： DNA - 主要遗传物质 RNA - 参与遗传信息 的表达及调控1. 概述 introductionBase + Ribose + PiF. Miescher1844-1895 210-12ab 肺炎球菌转化实验Oswald Avery et al. (1944) DNA分子中储存有遗传信息注射活有毒菌 致死注射活无毒菌 存活- 有荚膜的光滑型有毒菌- 无荚膜的粗糙型无毒菌转化作用 从一个供体得到DNA、通过特定途径转授给另一受体并使后者的遗传特性发生相应的改变

2、1877-1955310-12ce注射灭活的有毒菌 存活 活无毒菌注射 致死灭活的有毒菌 活无毒菌注射 致死灭活有毒菌的DNA4 噬菌体感染实验Alfred Hershey and Martha Chase (1952) 10-13用32P和35S分别标记DNA和外壳蛋白DNA注入菌体搅拌分离病毒外壳和菌体离心分离及放射性分析释出子代噬菌体NP in Phys. & Med. 19691928-2003 1908-1997 结论 用于复制噬菌体的遗传信息是通过其DNA而不是蛋白质外壳导入细菌的噬菌体DNA含32P外壳蛋白均无35S5710-1- 两类碱基均不饱和- 环呈平面状- max = 2

3、60 nm嘧啶嘌呤nucleotideconjugateddouble bondwithout it in pyridineimidazole ring核苷酸是核酸的构件分子8G11.10/12编号区分-N9-糖苷键-N1-糖苷键顺式构象时呈空间位阻nucleoside核苷是(脱氧)核糖的N-(糖)苷rapidly(cf. p159)10核苷酸是核苷的磷酸酯AMP10-62-AMP3-AMP2,3-cAMPnucleotide一定条件下亦可形成兼性离子(cf. p164)11G11.15 NMP磷酸化依次形成NDP和NTP水解时可释出更多能量12snake venom3,5-磷酸二酯键bovi

4、ne spleen35W34-10 (脱氧)核苷酸通过3,5-磷酸二酯键连接成(脱氧)核酸free dNTPdeoxy-PPi核酸聚合酶DNA/RNA chain(back to 10-36a) used for next attack14Erwin Chargaff 1905-2002 DNA的碱基组成是有规律的 - 具有种属特异性 - 同一个体没有组织/器官特异性 - 不会随个体的年龄、营养状况或 环境变化等而改变Chargaff rules (cf. p168)- 腺嘌呤和胸腺嘧啶的摩尔数相等：A=T- 鸟嘌呤和胞嘧啶的摩尔数相等：G=C- 嘌呤残基总量与嘧啶残基的相等：A+G=T+C这

5、一DNA碱基组成的定量关系暗示着A与T和G与C之间相互配对的可能性 核酸的高级结构1510-15 DNA的二级结构双螺旋模型James Watson & Francis Crick (1953)大沟小沟= 10.5个 碱基对original model17G12.9扭 曲- 糖环平面几乎与碱基平面成直角- 碱基平面与螺旋长轴垂直- 双螺旋结构稳定的主要维系力 a) 双链互补碱基对之间的氢键 b) 碱基堆积力 = 疏水互作 + 范德华力 (BSF: base stacking force) c) 链骨架上负电性磷酸基团提供的盐键18 Key concepts for DNA double hel

6、ix model- 两条反向(5 3)平行的多核苷酸链围绕同一中心轴 缠绕形成右手双螺旋- 两条链上的碱基通过氢键相互连接形成碱基(互补)对， GC, A=T，碱基均呈反式构象- 交替的脱氧核糖与带负电荷的磷酸骨架位于双螺旋的 外侧，糖环平面几乎与碱基平面成直角- 碱基堆积在双螺旋内部，碱基平面与螺旋长轴垂直， 依靠其疏水性和近似平面的环结构而紧密叠加在一起- 双螺旋平均直径为2nm (实测2.37)，相邻碱基对距离为 0.34nm (0.33)，相邻核苷酸夹角为36(34.6)，沿螺 旋长轴每转含10个(10.4)碱基对，螺距为3.4nm (3.6)- 碱基对的堆积和糖-磷酸骨架的扭转导致螺

7、旋表面形成 两条不等宽的沟(=调控分子作用处)1910-11ATGC H bonding patterns in base pairs defined by Watson & CrickW-C bps most stable20 DNA双螺旋具有不同构象 10-19 A B Z外形 粗短 适中 细长螺旋方向 右手 右手 左手螺旋直径(nm) 2.55 2.37 1.84碱基轴升(nm) 0.23 0.34 0.38碱基夹角() 32.7 34.6 60*碱基数/圈 11 10.4 12- W-C 模型依据的是B型- 自然态DNA多为类B型 间插有短序列A型- 自然存在的Z型很少2124-9/1

8、1/12自动形成的额外超螺旋可以抵消过旋或欠旋造成的应力 (环状)双螺旋可以形成超螺旋结构 relaxedincreased supercoilingbacterial plasmid DNAssupercoil22 tRNA二级与三级结构三叶草结构模型 (1965)二氢尿嘧啶假尿嘧啶Robert W. Holley1922-1993 1968 NP in Phys/Med2410-293. 核酸性质与研究技术 核酸双链在体外可以变性和复性 fastslowzippering变 性DNA双链受变性因素影响而使氢键、碱基堆积力及疏水键等破坏、双螺旋结构解体成单链(共价键不断裂)25H19.17T

9、m与溶液离子强度/pH密切相关 DNA的融解曲线Poly (GC)样品UV吸收值的增加等于DNA完全变性/解链时的一半- 盐可屏蔽磷酸骨架的负电荷 而有利于双链稳定及复性- pH可通过影响碱基解离 而干扰配对氢键的稳定82950.14摩尔法分离提纯DNP/RNPDNA/RNA2710-32 核酸分子杂交 (hybridization) =不同来源的核酸可以形成杂化体两种DNA的序列越相似，形成的杂化体越多- Southern Blotting 用探针检验DNA- Northern Blotting 用探针检验RNA已知序列并用32P标记的DNA/RNA分子/片段28 principle of

10、Southern blotting 将各种生物大分子从凝胶转移到一种固定基质上的过程 - 硝酸纤维素膜能同单股DNA/RNA强力结合29palindrome(b)H19.30- 两类限制性内切酶型既可催化宿主DNA的甲基化、又可切割没有甲基化的(外源)DNA型只具有核酸酶活性，另有单独起甲基化作用的限制性甲基化酶与之配套，催化在同一识别序列处碱基的甲基化 识别序列及方向 限制性内切酶是一类重要的DNA内切酶A残基在识别位点甲基化未甲基化的DNA断裂成黏性末端甲基化酶的高亲和性底物自体外源(eg. virus)3010-36aDNA合成酶作用需要 - 模板 - 引物 - dNTP生成磷酸二酯键(

11、cf. W34-10) DNA序列可通过双脱氧链终止法测定3110-36c 双脱氧链终止法 测定DNA序列(Frederick Sanger, 1977)NP in Chemistry 1980 缺乏继续反应生成磷酸二酯键的能力前提 电泳技术已发展至能够区分出仅具有单个核苷酸差异的DNA片段使同一套片段的末端均固定为同一种核苷酸32- 需要有限制性内切酶在特定位点切割DNA- 分离出的DNA片段能与作为载体的外源DNA连接- 有能力鉴别出含有重组DNA的载体克隆 制备外源DNA 在特定位点切割DNA和载体 将外源DNA片段与载体连接 利用载体将重组DNA导入宿主细胞(转化) 重组DNA在宿主菌

12、内大量复制 筛选和鉴别含有重组DNA的宿主细胞Paul Berg于1972年将外源DNA片段插入猴病毒SV40环状DNA分子内而首次获得DNA体外重组基本前提一般步骤常用E. coli的质粒，并以某种抗生素抗性基因标记(例如氨苄青霉素抗性基因) 利用特殊修饰酶可以制作重组DNA33H23.1 制作重组DNA 基本步骤key concept用同一种限制性内切酶切割外源DNA和质粒载体NP in Chemistry 1980for his fundamental studies of the biochemistry of nucleic acids, with particular regard

13、 to recombinant-DNA Paul Berg1926-34Kary B. Mullis1944-NP in Chemistry 1993for his invention (1985) of the polymerase chain reaction (PCR) method 每一轮循环经过变性、退火和延伸，DNA含量即增加一倍，通常扩增倍数可达106 DNA聚合酶链反应 PCR- 热变性95, 4560s(起始510 min)- 退火55, 1 min- 延伸72, 1 min(最后10 min)2530 cyclesgetting enoughtarget for DNAanalysis35作