栀子及其近缘类群的随机扩增多态DNA分析

1、栀子及其近缘类群的随机扩增多态DNA分析【摘要】目的探究栀子与其变种雀舌栀子、重瓣栀子及变型水栀子之间的亲缘关系。方法从56个随机引物中挑选出12个引物对栀子及其近缘类群进展RAPD分析，应用SPSS10.0分析软件中的Jaard方法计算任意两样品间的相似系数，用组内聚类方法计算得出聚类树状图。结果共得到251个有效位点。聚类分析显示，栀子与重瓣栀子最先聚类，然后与水栀子聚类，最后与雀舌栀子聚类。结论重瓣栀子与栀子亲缘关系最近，雀舌栀子与栀子的亲缘关系最远。【关键词】栀子；近缘类群；随机扩增多态DNARAPDAnalysisfrGardeniajasinidesandRelativesAbst

2、rat：bjetiveTprberelativerelatinshipangGardeniajasinides，itsvarietasG.jasinidesEllis.var.radiansandG.jasinidesEllis.var.frtunianaanditsfraG.jasinidesEllis.f.lngiarpa.ethdsRAPDanalysisfrsaplesfGardeniajasinidesandrelativesereperfredby12randprierssreenedfr56.PrxiityatrixasanalyzedbySPSSversin10.0andres

3、aleddistanelusterbineasbtainedbylusteranalysisithingrups.ResultsAttalf251plyrphiliereaplified.ItshedthatGardeniajasinideserelusteredithG.jasinidesEllis.var.frtunianaatfirst,thenithG.jasinidesEllis.f.lngiarpa,andithG.jasinidesEllis.var.radiansatlast.nlusinAngsaples,Gardeniajasinidesasthelsestrelative

4、tG.jasinidesEllis.var.frtuniana,andstdistantrelativetG.jasinidesEllis.var.radians.Keyrds：Gardeniajasinides；Relatives；RAPD栀子为常用中药，具有泻火除烦、清热利尿、凉血解毒的成效。分布在长江流域及以南地区，为酸性土壤指示植物。栀子有3变种和1变型17，即栀子GardeniajasinidesEllis.、雀舌栀子G.jasinidesEllis.var.radiansThunb.akin、重瓣栀子G.jasinidesEllis.var.frtunianaLindl.Hara.

5、、大花栀子G.jasindesvar.grandiflraNakai.、水栀子G.jasinidesEllis.f.lngiarpaZ.Xieetkada.，它们在形态构造上均具有一定的差异，为了探究它们之间的亲缘关系，笔者采用随机扩增多态DNArandaplifiedplyrphisDNA，RAPD的技术对其进展了分析。1器材1.1仪器PT100TPrgraableTheralntrllerJRESEARHIN，美国，高速离心机IEirBentrifugeIE公司，美国，DZK-型水浴锅河北省黄骅航天仪器厂，DYY5型稳压稳流电泳仪北京市六一仪器厂，凝胶紫外成像系统SYNGENEADIVIS

6、INfSYNPRISLTD，美国，核酸紫外定量仪GENEQUANTIIPharaiaBiteh，英国。1.2试剂Taq酶华美生物工程公司，200u，3l/l，琼脂糖西班牙，华美公司分装，dNTP华美公司，TABSiga公司，溴化乙锭Fluka公司，Tris碱UltraPure，华美公司，EDTA华美公司，巯基乙醇上海生工公司，随机引物上海生工公司，其余试剂为北京化工厂产的分析纯。1.3材料栀子、雀舌栀子、重瓣栀子、水栀子的叶片均由笔者采集鉴定，用硅胶快速枯燥保存，样品采取混合取样，编号见表1。2方法2.1DNA提取和浓度测定将干叶片约0.2g置于1.5lEP管中，参加液氮约30s后用镊子碾碎成

7、细粉，立即参加500l2TAB提取缓冲液TAB2，Tris-Hl(pH8.0)100lL-1，EDTA20lL-1,Nal1.4lL-1,巯基乙醇2和20l巯基乙醇，60水浴保温1h后，参加氯仿异戊醇241抽提，轻颠倒混匀，10000rin-1离心10in，汲取上清液，参加等体积TAB沉淀缓冲液TAB1，Tris-Hl(pH8.0)50lL-1，EDTA10lL-1,巯基乙醇1,室温下放置0.5h以上，10000rin-1离心10in，小心倾去上清液，沉淀用70乙醇和无水乙醇各轻洗1次，弃洗液，留沉淀挥干。用20lTE溶解备用。用0.8琼脂糖凝胶电泳，以DNA作对照和用核酸紫外定量仪测定浓度相

8、结合。表1实验材料来源、采集时间略2.2DNA模板浓度的选择用S267引物对DNA模板的不同浓度扩增结果比拟，选择扩增效果好的浓度进展扩增。2.3PR扩增25l反响体系：dNTPs10lL-11.5l，引物10lL-10.5l，DNA模板约42ng，Taq酶3l/l0.5l，gl225lL-11.5l，10ReatinBuffer2.5l。扩增程序为：预变性96，5in；扩增循环40个，为9445s，341in，721.5in；后延伸725in。取8l扩增产物于1.8琼脂糖凝胶上用1TAE电泳缓冲液电泳，凝胶紫外成像系统检测拍照。2.4引物挑选以1和2号两个模板，用随机引物在上述条件下扩增，选

9、择条带明晰、重复性好的引物作为扩增引物用于RAPD扩增。2.5数据分析电泳图谱中的每一条带DNA片段均为一个分子标记，并代表一个引物结合点，根据分子标记的有无及其迁移率统计得到有位点的二元数据，有带计为1强带与弱带同计，无带计为0。应用SPSS10.0分析软件中的Jaard方法计算任意两样品间的相似系数，用ithingrup聚类方法计算得出聚类树状图。3结果与讨论3.1从56个引物中挑选出12个条带明晰、多态性明显的扩增产物分子量在2002000bp之间的引物12个见表2，共得到251个有效位点，其中引物S28、S180对样品的扩增结果见图1。经SPSS10.0分析软件得任意两样品间的相似系数

10、见表3和聚类树状图见图2。图1S28，S180对样品扩增的产物电泳图谱略图2聚类树状图略3.2图2说明，样品4和5最先聚类说明其亲缘关系亲密，相似系数最大0.575亦说明了这点，它们为水栀子的不同居群，但样品4的结果率远低于样品5，样品4生于江西中医学院药用植物园，周围没有水源，生境相对较枯燥，且周围有较高的乔木遮挡局部阳光，而样品5生长于水沟两侧，周围是稻田，阳光和水分充足；样品4和5的差异可能是生态环境的不同而引起的。表2本实验所用引物序列略表3样品之间相似系数矩阵略3.3表3说明，样品1和样品3相似系数为0.574，样品1与样品2的相似系数为0.421，样品1与样品4相似系数为0.477

11、，遗传间隔 计算公式8为：DS=1SI，DS为遗传间隔 ，SI为相似系数，相似系数越大，遗传间隔 越小，亲缘关系那么越近。与样品1栀子相似系数比拟，样品3重瓣栀子0.574样品4水栀子0.477样品2雀舌栀子0.421，样品14均采自江西中医学院药用植物园，它们的生长环境一致，说明它们的差异来自物种内部。实验说明，重瓣栀子与栀子亲缘关系最近，雀舌栀子与栀子的亲缘关系最远。从形态上看，雀舌栀子为矮小灌木，叶小，花小且为重瓣，这些特征与其它种差异很大，图2聚类结果亦说明雀舌栀子与另几种关系较远。【参考文献】1谢宗万.水栀子的品种考证及品质评价刍议J.中药材,1991，14(7):45.2?浙江药用植物志?编写组.浙江药用植物志(下册).杭州:浙江科学技术出版社,1974：1212.3吴修仁.广东药用植物简编.广州:广东高等教育出版社，1989：450.4徐国钧.中药材粉末显微鉴定.北京:人民卫生出版社，1986：472.5中国科学院植物研究所.江苏南部种