细菌耐药监测的临床意义与抗菌药物的合理选用课件

1、细菌耐药监测的临床意义与抗菌药物的合理选用 中山大学附属三院 唐英春细菌的耐药是人类与细菌长期生存斗争的结果，从临床治疗的角度必须认识耐药的才能有的放矢，制定如何克服耐药微生物耐药的机理 1、复杂，常多重耐药。（细菌耐药机理状况,能在一定程度上反映出其本质，而细菌的耐药是复杂的，不是一成不变的，随着用药而改变，各国各地不同） 2、根据各国各地各单位监测细菌耐药状况了解分析耐药趋势，该处细菌耐药机理研究，制定用药方案，指导临床合理用药 如何避免产生耐药， 如何克服耐药， 如何选用相对敏感的药物治疗， 开发新药。 监测就是了解耐药重点必须包括主要的耐药菌：革兰阳性菌MRSA、VRE 和 DRSP(

2、PRSP)为代表。革兰阴性菌中棘手的细菌:大肠埃希菌，肺炎克雷白菌，绿脓假单胞， 不动杆菌，阴沟杆菌，嗜麦芽假单胞菌等产生超广谱-内酰胺酶）为代表多重耐药菌。 监测内容统一操作规范操作真实准确全面（苛氧菌）多点有代表性能说明目前耐药状况进行培养和菌落计数。中性粒细胞少而上皮细胞25，不合格 重新采集培养注意： 须氧菌； 加5%二氧化碳；厌氧菌： 动物接种后培养的菌。 药敏：杆菌常用敏感抗菌药 球菌常用抗菌药 要有标准菌株对照2、血培养：疑败血症者治疗前多次；感染性心内膜炎、伤寒、动脉内膜炎、布氏杆菌病菌血症持续存在24小时内每隔1小时采血1次；其他感染的菌血症可在寒战高热时采血并24-48小时

3、内分别采血3次，每次血量不少于10毫升（婴儿、儿童5毫升）最好床边立即培养有意义病原微生物的确定： 痰：争议较大 107CFU/ml为病原菌 104 107CFU/ml可能为病原菌，需结合涂片和培养的结果 104CFU/ml提示为污染均 真菌：三次同一菌阳性有菌丝，特殊染色微生物学检查细菌培养规范化：送检标本合格合理运送，定量培养药敏试验（作那些药敏，标准等严格使用NCCLS规定）纸片法，MIC 法 E-test法如何判断结果？监测细菌耐药的表现： 药效和耐药是同时产生的，了解耐药才能有针对性地遏制耐药，而正确的监测方法是准确的合理方案 MIC是药物体外抗菌活性的表现 MIC值上升或高峰后移是

4、药物体外抗菌活性下降、下降到一定的值就成为耐药 MSSA attB ccrA,B mecRI mecAType1 ccrA,B Tn554 mecI mecRI mecA Type2 ccrA,B Tn554 mecI mecRI mecAType3 Hg TcTc:对四环素耐药，Hg:对水银耐药的转座子Tn554带有对红霉素耐药，并载有插入型质粒pUB110耐氨基糖甙类的转座子有mecA基因不表现耐药，80年代已发现金葡菌中存在有带mecA基因而并不对甲氧西林耐药株，对此称为前MRSA，对mecA基因上游进行调查分析，发现在其上游存在控制mecA 基因活动的mecI mecRI基因。证实了m

5、ecI基因有控制mecA基因作用。 这些调节基因变异或缺失有重要意义。实验除去这些调控基因形成了耐药性和PBP2的表达，证实了mecI基因有控制mecA基因作用。近年来研究DNA水平的分型与多重耐药之间有一定的联系，其原因是其耐药株引起的感染不易控制而成为流行株（(EMRSA). mecI mecRI有吸引其他耐药决定因子整合到mec基因片段中。 葡萄球菌也可产生-内酰胺酶。金葡菌存在多种外排泵系统，已有很多报告。MRSA存在qacB qacJ Smr等多种主动外排系统其在多重耐药中起重要作用。 金葡菌可产生细菌生物膜，可形成被膜病生物膜使很多药物不能进入细菌内，而不能发挥抗菌作用，因其代谢等

6、变态反应成被膜病致使细菌可以长期在病灶潜伏，不被吞噬细胞作用。因某种原因细菌从膜内移出则发病 可成为游离菌使病灶再感染葡萄球菌属耐大环内酯类抗菌药物的耐药基因erm(erythromycin resistance methylase)（已发现至少有8类），其中常见的ermA ，ermC基因为葡萄球菌属耐药基因，对大环内酯类耐药，这些基因位于质粒和染色体上，引起交叉耐药。又因大环内酯类，林可霉素以及链阳菌素作用部位相似，三类药物常同时耐药，称谓MLS耐药，治疗时要注意药物选择。2、肺炎链球菌 亚洲地区ANSORP(Asian Network for Surveillance of Resista

7、nt Pathogens) 报道PRSP越南90% ，斯里兰卡85%， 韩国65%，香港68% ，台湾63%，泰国53 8% 。 这些菌同时耐红霉素等大环内酯类抗生素、克林霉素、及复方磺胺异恶唑等肺炎链球菌耐药机理 对青霉素耐药PRSP或 PRSP(penicillin resistant Streptococcus pneumoniae )链球菌有6种青霉素结合蛋白PBPs,PBP1a、 1b、 2a、 2b、 2x、 PBP3。PRSP中1b、 2a、 2b、 2x对-内酰胺类抗生素亲和力下降，不能与之结合，即不能阻碍细菌细胞壁的合成而耐药。高分子量蛋白有PBP1a、 1b 2a、 2b

8、、2x。其中2b和2x是其-内酰胺类抗生素耐药的决定因子、对-内酰胺类不同程度的耐药，2x变异可致头孢塞肟耐药。2b不与广谱头孢类作用，无耐药作用，低分子量蛋白PBP3，亲和力下降可致高水平耐药。 低亲和力PBP由突变的pbp基因编码，来自草绿链球菌，缓症链球菌同源基因序列，通过种间重组产生镶嵌结构，可以发生在不同位点，造成了PBP变异的多样性，其耐药在链球菌种之间可广泛水平及垂直传播。 来 源、变 异 基 因（1025 核 苷 酸 序 列 与 敏 感 株不 同）各 种 链 球 菌 外 源 基 因 敏感株 PBP 结构基因片段重组 变 异 基 因（镶 嵌 结 构） 多 种 位 点 S.P 以

9、多 种 方 式 改 变 PBP来 源：多 样重 组 位 点：多 样，可 水 平 传 播，可 纵 向 传 播对大环内酯类耐药靶位改变：大环内酯类与细菌核糖体50S亚基形成复合物，特异地抑制细菌蛋白质合成而发挥作用。耐大环内酯类肺炎链球菌可产生核糖体甲基化酶（ErmB）使23SrRNA的特定腺嘌呤甲基化而阻断药物和核糖体结合而耐药。核糖体甲基化酶由耐药基因erm(erythromycin resistance methylase) 编码，（已发现至少有8类）， 其中常见的ermA ermC基因为葡萄球菌属耐药基因，ermB为肺炎链球菌耐药基因而对大环内酯类耐药，这些基因位于质粒和染色体上，一般位于

10、结合转座子Tn1545上，引起交叉耐药。又因大环内酯类，林可霉素以及链阳菌素B作用部位相似，三类药物常同时耐药，称谓MLS耐药，治疗时要注意药物选择, MLS耐药性分为内在型(cMLS)和(诱导型(iMLS) ermB基因上游调控区决定其型的表达，一旦耐药ermB基因完全被诱导产生对所有大环内酯类，林可霉素以及链阳菌素B高水平耐药。不同国家耐药流行不同，意大利，西班牙，比利时其耐药以靶位改变多见。 主动外排系统：葡萄球菌，链球菌存在主动外排系统，最近报道肺炎链球菌有一种新的耐药表型，对14、15元环大环内酯类低水平耐药，对16元环大环内酯类、克林霉素、链阳菌素B敏感 ，为M型，其耐药是外排编码

11、基因mefA决定的，mefA依靠质子运动力泵出14、15元环大环内酯类抗生素。 对喹诺酮类耐药 靶位改变：喹诺酮类耐药是型拓扑异构酶即DNA促旋酶和拓扑异构酶，前者是由gyrA编码的两个 GyrA亚基和 gyrB编码的两个GyrB亚基组成的四聚体，后者是由 parC编码的两个ParC亚基和 parE编码的两个 ParE亚基组成的四聚体。细菌的gyrA和/或parC一段核苷酸序列与喹诺酮耐药密切相关，是其耐药决定区，DNA促旋酶和拓扑异构酶是细菌生长必须的酶， 肺炎链球菌对喹诺酮类耐药主要是DNA促旋酶和拓扑异构酶的一个或多个基因突变，导致相应氨基酸替代使药物不能与靶位结合。高水平耐药的表达须p

12、arC和gyrA双位点突变。不同基因突变表现出对不同喹诺酮类药耐药，诺氟沙星，环丙沙星，左氧氟沙星等主要作用靶位是拓扑异构酶，司帕沙星，莫西沙星，加替沙星等主要作用靶位是DNA促旋酶。 主动外排系统：Branwald研究表明45.4%对诺氟沙星，环丙沙星敏感性下降的肺炎球菌临床分离株显示了外排表型，所有外排表型的临床分离株和突变株对疏水性喹诺酮类耐药如司帕沙星，莫西沙星敏感。外排基因pmrA编码一个由399个氨基酸组成的蛋白质PmrA,与金葡菌，枯草芽孢杆菌外排蛋白有较高的同源性。 对其他药物耐药磺胺类：耐磺胺类肺炎球菌二氢叶酸合成酶编码基因silA突变导致耐药。氯霉素：耐药肺炎链球菌使氯霉素

13、乙酰化而是去活性，结合转座子Tn5253携带了耐邀基因盒，Tn5253是复合转座子，由四环素耐药转座子Tn5251和一个氯霉素耐药的转座子Tn5252组成。肺炎链球菌无耐药质粒，耐氯霉素肺炎链球菌与金葡菌的质粒pc194的基因盒完全一致，由金葡菌的质粒pc194整合到肺炎球菌染色体导致耐氯霉素。 3、VRE：肠球菌是多重耐药菌 其感染以粪肠球菌为主，屎肠球菌其次, 肠球菌带有对多种抗菌药物的抵抗性，1970年以后美国等报告散发的MRSA感染病例，万古霉素成为治疗MRSA感染的唯一药物。正如所有抗菌药物一样过于广泛大量使用、经过30年左右其后果是耐药（不包括自然耐药） 1986年英国在22名肾功

14、能不全患者发生院内感染后分离出耐万古霉素肠球菌。其分离率在欧美在增加。 国外耐药问题严重，国外报道后者耐药更高。以欧洲为甚，VRE1989 年美国0.4% ,1993年升为7.9% ， 1995 年超过 10% 。国内2005年中山三院报道1995年广州地区细菌耐药检测VRE中粪肠球5.6% （5/89）屎肠球3.7%（1/27） 1986年英国院内感染出现了肠球菌耐药，后来发现在鸡饲料中作为发育促进剂添加的多肽类产生了肠球菌耐药2002年美国发现的VRSA可能是耐万古霉素肠球菌携带的基因VanA传至MRSA造成的。金葡菌、肠球菌的耐药非常复杂，两者的关系目前最引人注目的是耐万古霉素。 呼吁全

15、体医生万古霉素的合理应用非常重要MRSA与VRE关系密切，肠球菌对万古霉素耐药型 主要的有3种型耐药基因型被称为VanA,VanB,VanC，已在粪肠球菌和屎肠球菌发现，此外还有耐药VanC,VanD,VanE基因。这些基因群在转移性基因上，VanA基因在质粒上，这些转移性基因插入质粒基因介导至其他细菌或其他种细菌，VanB，VanC，VanD,VanE型基因在染色体上，为染色体介导，带Van基因的肠球菌对万古霉素和替考拉宁敏感性不同。 Van基因可能接合的菌种接受菌 传播频度E.faeciumBM4107 10-4E.faecalisBM4110 210-8S.pyogenesBM105 1

16、.710-8*S.aureus80CR5tr 1000 16-512 质粒 VCM TEIC D-lac VanB 4-1000 0.5-1 染色体 VCM D-lac VanC 2-32 0.5-1 染色体 没有 D-SerVanD 64 4 染色体 不清楚 D-lac VanE 16 0.5 染色体 VCM D-Ser革兰阴性菌多数是多重耐药，我国研究较多的是耐酶问题，产酶也是革兰阴性菌耐药的主要原因之一 1989年Bush功能分类表（1）组别 -内酰胺酶 特点 1 头孢菌素酶 不被克拉维酸抑制 2a 水解青霉素 被克拉维酸抑制 2b 广谱酶 被克拉维酸抑制 2be 超广谱酶 被克拉维酸抑

17、制 2br 耐酶抑制剂广谱酶 不被克拉维酸抑制 2c 水解羧苄西林 被克拉维酸抑制 -内酰胺酶功能分类（2） 2c 水解羧苄西林 被克拉维酸抑制 2d 水解氯唑西林 被克拉维酸抑制 2e 水解头孢菌素 被克拉维酸抑制 3 金属 -内酰胺酶 不被克拉维酸抑制 4 水解青霉素 不被克拉维酸抑制1、1型-内酰胺酶（Amp C酶）特点可通过抗生素诱导，持续高产。大多数革兰阴性菌可产生，以肠杆菌属、枸橼酸杆菌属、绿脓杆菌多见，诱导性表达时水平增高数十至数百倍。野生型阴沟肠杆菌、弗劳地枸橼酸杆菌可表现为低水平持续表达，三代头孢菌素是弱诱剂，基因调节序列amp D基因自发突变率为10-510-7，可使细菌去

18、阻遏，导致酶活性和表达上调。三代头孢菌素导致去阻遏突变株发生的重要因素。AmpC酶的功能特征突变株耐第三代头孢菌素和酶抑制剂。 碳青酶烯类也是诱导剂，但对酶相对稳定，无选择型去阻遏突变株作用。AmpC酶主要由染色体和质粒介导。对4代头孢菌素，碳青酶烯类敏感，可选择治疗。 2、ESBL是-内酰胺酶中普遍存在而治疗麻烦的问题，来自大肠埃希菌和克雷白菌属，我国上海地区2005年报道2003年其检出率分别为33.6 % ， 44.2%,较2001年、2002年均明显上升。属于Bush分类的2be型-内酰胺酶（超广谱 -内酰胺酶，ESBLs）大多数肠杆菌科均产生，常见肺炎克雷白菌、大肠杆菌及其他阴性杆菌

19、如阴沟、异型枸橼酸杆菌。可水解广谱青霉素、头孢菌素（包括三代头孢菌素）单环类如氨曲南，但对头霉素和碳青霉烯类无明显作用。ESBLs可通过质粒介导或菌株克隆的传导致医院感染的暴发，全球发现100种亚型以上ESBLs，每年还在以1-2个新亚型的速度增加。 ESBLs耐药谱宽 、耐药程度重、传播广、遍及世界各地。 超广谱-内酰胺酶（ESBLs）的分型及特点TEM和 SHV型ESBLs：由TEM-1,TEM-2和SHV-1的突变而来，最为多见；TEM型有65种，SHV型27种。特点：对头孢他啶和氨曲南中-高度耐药，对头孢噻肟耐药程度较低，酶抑制剂可以抑制其活性。CTX-M型ESBLs：已发现 CTX-

20、M-1 - CTX-M-21型。特点：高度耐头孢塞肟，对酶抑制剂、头孢他啶敏感。高水平则耐CTX-M有CTX-M1CTX-15，高度耐头孢塞肟，对酶抑制剂、头孢他啶敏感。 PER型ESBLs：已发现PER-1和PER-2两种亚型，特点：可水解3、4代头孢菌素和氨曲南，不被克拉维酸抑制但对他巴唑敏感TOHO型ESBLs：已发现TOHO-1和TOHO-2两种亚型。特点：耐头孢塞肟、氨曲南，对头孢他啶、4代头孢和酶抑制剂敏感。 VEB型ESBLs：仅发现VEB-1。 能水解对3、4代头孢、氨曲南，对酶抑制剂敏感，头孢西丁和头孢呋新有协同效应。催产克雷白菌高产的染色体介导的K1,CTX-M族酶，部分O

21、XA型酶及其他少见酶。3、OXA(氯唑西林酶）：窄谱，其中有些水解广谱头孢菌素，已发现7种，棒酸对其抑制作用弱。4、耐酶抑制剂酶（IRT),金属酶碳青霉烯酶、羧苄西林酶等均少见。3、 AmpC酶和ESBL并存在耐药菌中常与是治疗的大难题。 张永标等检出AmpC酶和ESBL并存的大肠埃希菌和肺炎克雷白菌各占8.9%（4/45），7.7%（5/65），对碳青霉烯类敏感。从9株质粒中检出AmpC酶 基因为DHA-1 亚型，一株同时检出 ACT-1亚型。4、碳青霉烯酶 随着抗生素广泛使用耐药不动杆菌和窄食假单胞菌属的耐药成了关注的热点。 美国Sentry2003年报告非发酵菌中不动杆菌占18.7%，其

22、中11%耐亚胺培南，12%耐美罗培南，同年欧洲Mystic报告19972000年后者达14%前者更高16%.上海2002年于检测不动杆菌耐亚胺培南2.5%耐美罗培南4.1%比阿 培南6.0%Ambler分类有D B A3类，B也称金属酶，是以金属离子为活性中心的酶，特点：对酶抑制剂及包括碳青霉烯类在内的几乎所有-内酰胺类抗生素耐药，（代表菌不动杆菌、铜绿假单胞菌、肺炎克雷白菌、沙雷氏军菌属、 窄食假单胞菌）Bush分类为3，有三个功能亚群：3a、3b、3c和三个结构亚型Ba，Bb,Bc。3a：底物为广谱青霉素类、头孢类、碳青霉烯类（氨曲南例外）。3b ：易水解碳青霉烯类（碳青霉烯酶）。3c：水

23、解头孢类和碳青霉烯类D类碳青霉烯酶（OXA酶）： Bush分类为2d类水解苯唑西林（代表菌不动杆菌）,对亚胺培南，美罗培南有边界水解活性，合并有外膜通透性下降或主动外排时导致耐药。A类碳青霉烯酶少见。碳青霉烯酶一旦产生治疗困难。我国已发现其中一些亚型如Imp9 OXA-23 合理用药是艰苦的工作，确切作到很不容易。以下几点可参考：合理使用抗生素，避免耐药的发生， 选好适应症：确实需要使用抗生素； 确实需要使用那种抗生素 首先要有病原学的支持，尽量作到了解致病菌什么？有那些耐药的可能性？用什么药合适？ 对于该个体药量应该用多少合适？科学地分析病人的病原学，必须有详细的病史，用药史，病人治疗反应，

24、详细地检查，准确的微生物资料药理学知识，细心地观察疗效和不良反应，修正方案，选择合理的药物。 药物的疗效取决于药效学和药代学药效学：体外试验，包括MIC,E-Test,纸片敏感试验，不能完全说明敏感或耐药问题 完全依赖体外药敏选择治疗，常带来治疗的失败，因为未考虑药物在体内的作用药代动力学研究药物的吸收、分布、代谢、作用。以上两者共同决定抗菌药物的选择。合理用药包括良好的药效学和药代学抗菌药物合理使用包括（一）抗菌药物合理使用的管理 ；卫生部等三部联合发布抗菌药物使用指导原则，将通过领导部门加以管理。抗菌药物合理使用的管理 1 抗菌药物应明确规定为处方药物 2 加强细菌耐药性监测研究 3 加强

25、各级医院临床微生物检验实验室的建设 4 加强医师定期的知识更新再教育 5 加强对公众正确对待感染性疾病的宣传教育 6 加强对药品市场营销的管理（二）抗菌药物合理使用的技术 包括医务人员、微生物学、药学、患者共同努力抗菌药物合理使用的技术：循证1 根据细菌耐药监测结果，决定抗菌药物使用2 根据抗菌药物PK-PD相关性,制定抗生素使用策略 （1）浓度依赖性抗菌药物的PK/PD指证 （2）时间依赖性抗菌药物的PK/PD指证3 根据感染严重程度分级制定抗生素使用策略4 根据耐药现状制定抗菌药物换药策略5 抗菌药物的联合用药策略3、根据感染严重程度选用抗生素 选好适应症，是否该用，用那一类抗菌药， 轻、

26、重、中，有无基础疾病，有无免疫功能低下，年老，肝肾功能损害，4、根据耐药现状制定抗菌药物换药策略5、抗菌药物的联合用药策略4、根据微生物学（病原学）药效学和药代学选择抗菌药物5、根据耐药情况决定换药6、抗菌药物的联合用药策略1、根据细菌耐药检测2、PK-PD相关性制定抗生素使用策略（1）浓度依赖性抗菌药物：包括喹诺酮类，氨基糖苷类， 四环素，克拉霉素，阿奇霉素，甲硝唑。 判定本类药物能否达到满意疗效的指证为： PK/PD：AUC/MIC (AUIC) 或 Peak/MIC AUIC 125 Peak/MIC 10-12. 5 PK=Pharmacokinetics, 药代动力学 PD=Phar

27、macodynamics, 药效动力学 AUC: 曲线下面积 (PK参数) Peak: 血峯浓度 (PK参数) MIC: 最低抑菌浓度 (PD参数)（2）时间依赖性抗菌药物：包括-内酰胺类，林可霉素类，红霉素及糖肽类抗生素等 评价时间依赖性抗菌药物治疗方案 是否能达到杀菌目的的指标为： TimeMIC（TMIC） TimeMIC 40%50%（一般可达到满意杀菌效果） TMIC 60%70%（能达到很满意杀菌效果） TMIC 是指在治疗药物的药时曲线上，用该药对主要致病菌的MIC90值做标线，求出超过MIC90 的血药浓度维持时间占给药间隔时间的百分率. TimeMIC 计算举例： 医生向病人

28、说明和解释合理用药的重要性，病人可能希望用某种并不适合他的药，取得他的配合，不怕得罪病人。国家权威机构加强管理和监督，全世界都在重视合理应用抗菌药物，who已向各国呼吁，到各国调查，我国卫生部为全球遏制抗菌药物耐药已发出通知，召开会议，组织全国耐药监测。严格作到各行各业的严格管理，避免滥用抗菌药物。新药的研制的把关。 选择抗生素的举例1、特殊人群：老人，有基础疾病，接受特殊治疗，粒细胞降低，孕妇，心肝肾受损害等病原菌复杂，耐药菌多，2、病人免疫功能：是否接受免疫抑制治疗、器官移植治疗、免疫功能受损？耐药菌多，混合（合并真菌、病毒）感染多。3、社区感染：链球菌，金葡菌，4、医院感染：早期简单，晚期复杂抗菌药物经验治疗的选择1 分析可能的致病菌及其对抗菌药敏感性 G+菌还是 G-菌，是球菌还是杆菌，是敏感菌还是耐药菌2 根据感染发展规律及其严重程度选择抗菌药物，可能导致的后果 3 分析感染与基础病的关系选择抗菌药物G+球菌 金黄色葡萄球菌可选择 ： 耐酶青霉素苯唑西林，邻氯西林， 氟氯西林。 （MSSA） 可更换：一代头孢菌素，红霉素 ，新大环内酯 类，林可类， ，氨基糖苷类，碳青霉烯类（重症）金黄色葡萄球菌可选择 ：糖肽类：万古霉素，去甲万古霉素， 替考拉宁 ， （MRSA） 可更换：新糖肽类或新抗阳性球菌药物联