基因克隆酶学基础

1、关于基因克隆的酶学基础第1页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第四章 分子克隆的酶学基础 基因的重组与分离，涉及到一系列相互关联的酶促反应。特别是核酸限制性内切酶 和DNA连接酶的发现和应用，使DNA分子的体外连接与切割成为可能。 核酸限制性内切酶和DNA连接酶是重组DNA技术赖以创立的重要酶学基础。第2页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四重组DNA实验中常使用的酶II型核酸内切限制酶DNA连接酶大肠杆菌DNA 聚合酶反转录酶多核苷酸激酶末端转移酶核酸外切酶III核酸外切酶碱性磷酸酶S1核酸酶Bal31核酸酶TaqDNA聚合酶第3页，共107页，20

2、22年，5月20日，5点52分，星期四DNA的一级结构 DNA的二维结构第4页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四核酸酶通过切割相邻的两个核苷酸残基之间的磷酸二酯键，导致核酸分子多核苷酸链发生水解断裂的蛋白酶叫做核酸酶。专门水解断裂RNA分子的叫做核糖核酸酶（RNase) ；特异水解断裂DNA分子的则叫做脱氧核糖核酸酶（DNase）。从核酸分子末端开始,一个核苷酸一个核苷酸地消化降解多核苷酸链,称为核酸外切酶（ exonuclease）；从核酸内部切割磷酸二酯键使之断裂为小片段的为核酸内切酶（endonuclease）。 第5页，共107页，2022年，5月20日，5点52

3、分，星期四第6页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第一节、核酸内切限制酶与DNA分子的体外切割寄主控制的限制与修饰现象(R/M)修饰的甲基转移酶核酸内切限制酶EcoBEcoK（Restriction and modification） 第7页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四E.coli 菌株噬菌体感染率 KBCE.coli K110-410-4E.coli B10-4110-4E.coli C111说明K和B菌株中存在一种限制系统可排除外来的DNA第8页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四GAATTCCTTAAGEcoR IM

4、EcoR I限制作用修饰作用G3 5 AATTCCTTAA5 3 GGAATTCCTTAAGMeMeMeEcoR I核酸内切限制酶EcoR I 及其修饰的甲基化酶MEcoR 的限制与修饰作用第9页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第10页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第11页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四寄主的限制与修饰的作用保护自身的DNA不受限制;破坏外源DNA,使之迅速降解第12页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四2.限制酶的发现60年代提出了限制性内切酶和限制酶的概念1968 年，首次从 E

5、.coli K 中分离到限制酶 有特定的识别位点但没有特定的切割位点，切割位点离识别位点达 1000bp 以上。1970 年 ，美国约翰霍布金斯大学的 H. Smith找到 Hind 限制性内切酶 。2006年2月为止共发现3773种限制酶,810种甲基化酶 第13页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四核酸内切限制酶(restriction endonuclease)是一类能够识别双链DNA分子中的某种特定核苷酸序列（4-8bp），并由此处切割DNA双链的核酸内切酶第14页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四3. 核酸内切限制酶的类型特性I型酶II型酶I

6、II型酶蛋白质结构3种亚基单一成分2种不同亚基辅助因子ATP, Mg2+, S-MetMg2+ATP, Mg2+, S-Met序列特异切割不是是是切割位点距识别序列1kb处随机切割识别序列内或附近距识别距离下游24-26bp处克隆中的作用无用十分有用用处不大第15页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四4. II型核酸内切限制酶的基本特性在特异识别序列切割DNA分子；两个单链切割部位在DNA分子上的分布,通常不直接相对；断片往往具有互补的单链延伸末端。(1) 基本特性第16页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四识别序列4-8个核苷酸序列大部分呈旋转对称、反

7、向重复结构回文结构C-C-G-C-G-GG-G-C-G-C-C对称轴切割位点切割位点第17页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四 A B C C B A A B B A AB C C B A A B A B 部分识别序列不对称:AccBS :CCGCTC GGCGAG BssS : CTCGTG GAGCAC 有一些限制酶可识别多种序列 AccI GT MKAC (M:A或C) HindII GTY RAC(Y:C或R:A或G)第18页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四识别位点在DNA分子中的频率假定核苷酸随机排列的情况下进行 实践中:如 DNA长49

8、kb，对于六碱基的酶应该有12个切割位点，实际上要少一些，如Bgl II只有6个，BamHI只有5个，而SalI只有2个。44=25646=4096第19页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四基因组中碱基对的排列是非均匀的 ，尽管有的酶切序列中 GC 含量相同，但在基因组中出现的机率还是不一样。 在 E.coli 中 Aso（GGCGCGCC） 20kb Not（GCGGCCGC） 200kb （常利用它出现的机会少来构建图谱） EcoR 和 Hind 5kb Spe（ACTAGT） 60kb第20页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四细菌基因组（Bac

9、teria genome)大多数富含A+T的细菌中，CCC和CGG的排列是最少见的，所以含有这两种序列的识别序列出现的几率就非常少。酵母基因组（Yeast genome)G+C含量38%， 在重复序列之外，富含G+C的识别序列就特别少。哺乳动物中含CG序列的酶切位点稀少，大多CG序列是甲基化的第21页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四(2)、 限制性内切酶产生的末端粘性末端Cohesive ends (Mached ends) 5粘性末端, 3突出末端平末端 Blunt ends非对称突出端第22页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四粘性末端Cohes

10、ive ends (Mached ends) DNA分子在限制性内切酶的作用下形成具有互补碱基的单链延伸末端结构,能够通过互补碱基的配对而重新连接起来.EcoRI切割位点5-GAATTC-33-CTTAAG-5a .在对称轴的5一侧切割底物， DNA双链交错断开，形成5突出末端第23页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四EcoRI等产生的5粘性末端5 G-C-T-G-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-G-C-T-C 5EcoRI 37 5 G-C-T-G-OH P-A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A-P

11、OH-G-C-T-C 5退火 4-7 5 G-C-T-G A-A-T-T-C-G-A-G 33 C-G-A-C-T-T-A-A G-C-T-C 5OHPPOH第24页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四b .3一侧切割形成3突出末端5-CTGCAG-33-GACGTC-5PstI切割位点第25页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四PstI等产生的3粘性末端5 G-C-T-C-T-G-C-A-G-G-A-G 33 C-G-A-G-A-C-G-T-C-C-T-C 5PstI 37 5 G-C-T-C-T-G-C-A-OH P-G-G-A-G 33 C-G-A

12、-G-P OH-A-C-G-T-C-C-T-C 5 5 G-C-T-C-T-G-C-A G-G-A-G 33 C-G-A-G A-C-G-T-C-C-T-C 5OHPOHP第26页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四5突出端易于通过DNA激酶和32p ATP进行同位素标记3突出端是末端转移酶的理想作用底物,在酶的作用下,容易使DNA片段带上多核苷酸尾第27页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四在对称轴上同时切割DNA的两条链5-GCGGCCGC-33-CGCCGGCG-5平末端 Blunt ends第28页，共107页，2022年，5月20日，5点52分

13、，星期四PvuII等产生的平头末端5 G-C-T-C-A-G-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-G-A-C-C-T-C 55 G-C-T-C-A-G-OH P-C-T-G-G-A-G 33 C-G-A-G-T-C-P OH-G-A-C-C-T-C 5 PvuII 37 第29页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第30页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四 同裂酶（Isoschizomer): 识别位点的序列相同的限制性 内切酶 完全同裂酶:识别位点和切点完全相同：如MobI和Sau3AI 识别序列切割位点为 GATC 不完全同裂酶:

14、识别位点相同，但切点不同如AatII(GACGT C )ZraI(GAC GTC)同尾酶(Isocaudiners):识别的序列不同，但能切出相同的粘性末端。如 BamH I、Bgl 、Bcl I、Xho 等EcoR GAATTC Mfe CAATTC Apo RAATTYR: A or G;Y:C or T第31页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四具粘性末端的DNA片段结合方式 限制性片段末端连接作用a.具有EcoRI粘性末端的2条DNA片断之间的连接b.具有粘性末端的同一条片断的自我连接第32页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四属名头一个字母+种

15、名头两个字母菌株名不同修饰体系系统名 Haemophilus influenzae d 嗜血流感杆菌d株 HindIII6. 核酸内切限制酶的命名法第33页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四DNA 片段（线性载体）检测末端长度对切割的影响时，同样发现识别序列的末端长度对酶切效率有明显影响，不同的酶对末端长度的要求是不同。因此设计 PCR 引物时，引入酶切位点时，在位点之外加上能够满足要求的碱基数目。双酶切多克隆位点时选择合适的酶切秩序 第34页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四7、位点偏爱(site preference)某些限制酶对同一介质中的有些

16、位点表现出偏爱性切割，即对不同位置的同一个识别序列表现出不同的切割效率的现象称作位点偏爱 (1) 现象：EcoR 酶切割 噬菌体中的 5 个位点时并不是随机的，靠近右端的位点比分子中间的位点切割快 10 倍；EcoR 对腺病毒 2（adenvirus-2）DNA 不同位置切点的切割速率也不同。EcoR 和 Hind 在 噬菌体 DNA 中的切割速率分别有 10 倍和 14 倍的差异 噬菌体 DNA 有 4 个 Sac 位点，三个在中央，一个在右臂，对中央三个位点的酶切速度快 50 倍 第35页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四8.II 型核酸内切酶的多酶联合酶解：对盐浓度

17、要求相同的酶，原则上可以同时酶切，对盐浓度要求不同的酶，可采取下列方法：使用较贵的酶的盐浓度，加大便宜酶的用量，同时酶解低盐酶先切，然后补加盐，高盐酶再切一种酶先切，然后更换缓冲液，另一种酶再切酶切温度要求不同时,先低温切,后高温切第36页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四注意事项取少量酶最后加酶减少反应体积反应时间的延长 分装（对于多个反应）第37页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第38页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四9、影响酶活性的因素 (1)DNA的纯度:蛋白质、苯酚、氯仿、乙醇、EDTA, SDS、NaCl等提高对

18、低纯度DNA酶切效率的方法:增加核酸内切酶的用量,1ugDNA/10u;扩大反应体积,稀释抑制因素延长酶切保温时间 第39页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四(2)甲基化程度:大肠杆菌中的dam甲基化酶在5GATC3序列中的腺嘌呤N6位引入甲基 (3)缓冲液 pH,Mg2+ ,DTT,BSA,10(X)(4) 酶切消化反应的温度 大多数为 37,少数 25-30 smalI(25);ApaI(30)(5)DNA的分子构型与切割 DNA 相比，EcoR、Pst、Sal 需要至少 2.5-10 倍的酶来切割 pBR322 的超螺旋 DNA。 第40页，共107页，2022年，

19、5月20日，5点52分，星期四(6)、酶的星星活性（star activity)在极端非标准条件下，限制酶能切割与识别序列相似的序列，这个改变的特殊性称星星活性 星星活性是限制性内切酶的一般性质，任何一种限制酶在极端非标准条件下都能切割非典型位点 Apo、Ase、BamH、BssH11、EcoR、EcoRV、Hind、Hinf、Kpn、Pst、Pvu、Sal、Sca、Taq 和 Xmn 等酶皆可表现出星星活性。 第41页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四高浓度的酶、高浓度的甘油、低离子强度、极端pH等会使一核酸内切酶的识别和切割序列发生低特异性，即所谓的Star acti

20、vity现象甘油浓度高（5%） 酶过量（100U/l） 离子强度低（8.0） 有机溶剂如 PMSD （二甲基亚砜）、乙醇、乙二醇、二甲基乙酰胺（dimethylacetamide）、二甲基甲酰胺（dimethbylformamide）、 sulphalane 等等. 用其它二价阳离子如 Mn+ 、Cu+、Co+ 或 Zn+ 代替了 Mg+ 。 第42页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四10、 酶切位点的引入（1）产生的 5 突出端补平后，再连接可产生新的酶切位点 （2）同尾末端的连接 不同的同尾酶切割 DNA 产生的末端再相互连接时，可产生新的酶切位点，同时原来的酶切位点

21、消失 BamH（GGATCC）+ Bcl（TGATCA） Alw（GGATC 4/5） 第43页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四（3）平末端的限制酶切割的DNA在连接后也可产生新的酶切位点 Pvu（CAGCTG）+ EcoRV（GATATC） Mob（GATC） 第44页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四限制性核酸内切酶反应的终止65或80 温浴20分钟加入EDTA（10mM)终止第45页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第二节、 DNA连接酶 催化双链DNA片段靠在一起的 3羟基与5磷酸之间形成磷酸二酯键，使两末端连接起来的

22、酶。 两种DNA连接酶大肠杆菌连接酶:是一种相对分子量为74000的蛋白质,催化时需NAD+做能量,只能连接粘性末端T4噬菌体连接酶:相对分子质量60 000,需ATP做为能量来源,可连接粘性末端和平末端连接的条件:DNA3端有游离的-OH,5端有P;需要能量;必须是两条双链DNA.只封闭双螺旋DNA骨架上的缺口第46页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四1T4 DNA 连接酶（T4 DNA ligase） T4噬菌体感染大肠杆菌产生底物：粘端、切口、平端的 RNA （但效率低）或 DNA 影响因素：低浓度的聚乙二醇 PEG （一般为 10%）和单价阳离子（150-200m

23、M NaCl）可以提高平端连接速率。第47页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四2E.coli DNA 连接酶（E.coli DNA ligase）与 T4 DNA ligase 活性相似，但需烟酰胺-腺嘌呤二核苷酸（NAD+）参与。平端连接效率低，常用于置换合成法合成 cDNA 不能将 RNA 连接到 DNA ，不连接 RNA 。第48页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四3Taq DNA 连接酶在两个寡核苷酸之间进行连接反应，同时必须与另一DNA 链形成杂交体，相当于连接 dsDNA 中的缺口作用在 4565 需 NAD+ 。可用于检测等位基因的变化

24、在 PCR 扩增中引入寡核苷酸。它不可替代 T4 DNA ligase 。第49页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四二、连接反应的机理ATP（NAD+)提供激活的AMPATP与连接酶形成共价“连接酶-AMP”复合物，并释放出焦磷酸PPi。AMP与连接酶的赖氨酸-氨基相连AMP随后从连接酶的赖氨酸-氨基转移到DNA一条链的5端P上,形成“DNA-腺苷酸”复合物 3-OH对磷原子作亲核攻击，形成磷酸二脂键，释放出AMP第50页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第51页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四 DNA连接酶第52页，共107

25、页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第53页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四四、影响连接反应的因素1 反应温度 16 反应，4 小时； 4 反应，反应过夜2 连接酶的浓度Weiss 单位 在 37 下 20 分钟催化 1 nmol 32p 从焦磷酸根置换到， 32PATP 所需的酶量，定义为 1 个 Weiss 单位。 NEB单位 在 20l 反应体系中于 16 ，使 Hind 切过的 DNA （300g/ml，0.12M 5 末端）在 30 分钟内连接 50% 所需的酶量为 1 个 NEB 单位。 1 NEB = 0.015 Weiss 1 Weiss =

26、67 NEB 平末端连接反应的酶量大约是1-2个单位,粘性末端仅为0.1个单位,3 ATP浓度4 DNA片断末端 自身环化的单体，线性二聚体或多聚体，分子间连接，重组质粒第54页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四插入片段与载体的浓度比例3-10：1；碱性磷酸酶处理载体目的片段的量的计算提高连接效率的方法第55页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第三节、 DNA 聚合酶（DNA polymerase ）和反转录酶 作用：在有模板，引物存在下，把脱氧核糖单核苷酸 （dNTP）连续加到双链DNA分子引物链的3-OH端，催化核苷酸的聚合作用。一 基因工程中常

27、用的DNA聚合酶大肠杆菌DNA聚合酶， Klenow fragment T7 DNA聚合酶 T4 DNA聚合酶 修饰过的T7 DNA聚合酶 反转录酶第56页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四二、 DNA聚合酶的作用DNA聚合酶 I 与核酸杂交探针的置备；大肠杆菌DNA聚合酶的Klenow片段与DNA末端标记；T4 DNA 聚合酶和取代合成法标记DNA片段；依赖于RNA的DNA聚合酶与互补DNA 的合成；第57页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四（一）、 E.coli DNA 聚合酶 1.基本活性 5-3 DNA 聚合酶活性。底物：为单链 DNA ，引

28、物（带 3-OH 基） 或 5 突出的双链 DNA 。 5-3 外切核酸酶活性 底物：双链 DNA 或 DNA:RNA 杂交体活性：从 5 端降解双链 DNA ，也降解 RNA:DNA 中的 RNA（RNase H 活性） 第58页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四 3-5 外切酶活性底物：带 3-OH 的双链 DNA 或单链 DNA 活性： 3-OH 端降解 DNA ，可被 5-3 聚合活性封闭，也可被带 5 磷酸的 dNMP 所抑制。 在没有 dNTP 的情况下，外切活性占主导地位，而当存在足够的 dNTP 时，外切活性和合成活性将处在动态平衡中，结果使得双链 DNA

29、 成为平末端。第59页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四DNA聚合酶 I 聚合活性第60页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四DNA聚合酶 I 的5-3核酸外切酶活性第61页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四2E.coli DNA 聚合酶 的用途切口平移法（nick translation ）标记 DNA 所有 DNA 聚合酶中只有此酶有此反应 53Mg2+,DNaseIdNTP,DNA polyI切口平移第62页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四探针标记双链DNA分子由DNaseI产生的单链缺口,带有3OH

30、末端大肠杆菌DNA聚合酶I 的5 3外切酶活性从缺口5-P一侧移去一到数个核苷酸大肠杆菌DNA聚合酶I将32P标记的核苷酸掺入取代原先被删除的核苷酸重复进行和(d),使缺口沿着5 3方向移动.第63页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四（二）、Klenow DNA 聚合酶 E.coli DNA polymerase large fragment （Klenow fragment）大肠杆菌DNA聚合酶I经蛋白酶（枯草杆菌蛋白酶）裂解而从全酶中除去 5-3 外切活性的肽段后的大片段肽段，而聚合活性和 3-5 外切活性不受影响，分子量为 76kDa 。第64页，共107页，202

31、2年，5月20日，5点52分，星期四活性：与 E.coli DNA 聚合酶 的活性是一致的。但没有 5-3 外切活性作用： 补平 3 凹端 DNA 。要加足够的 dNTP 抹平 DNA 3 凸端。必须加足量 dNTP 在 cDNA 克隆中合成第二链。随机引物标记。 应用于 Sanger 双脱氧链末端终止法的 DNA 测序（已经被 T7 DNA 聚合酶取代） 第65页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四DNA分子末端标记第66页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四（三）、T4 噬菌体 DNA 聚合酶（T4 phage DNA polymerase） 来源于

32、 T4 噬菌体感染的 E.coli ，分子量为 114kDa 活性： 与 Klenow 酶相似，但 3-5 外切活性强 200 倍 53聚合活性第67页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四用途用于补平或标记3凹端取代合成（需高浓度dNTP一种)-末端标记标记DNA片段 利用外切活性产生3凹端再补平第68页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四（四）、T7 噬菌体 DNA 聚合酶（T7 phage DNA polymerase） 来源于 T7 噬菌体感染的 E.coli ，为两种紧密结合的蛋白质复合体，一种是噬菌体基因 5 蛋白，另一个是宿主蛋白的硫氧还蛋白

33、。 聚合能力最强的DNA聚合酶；聚合过程中不形成二级结构；可进行单纯的延伸或取代合成的途径；在从5到3方向的聚合过程中也有一定程度的35核酸外切酶活性；将双链DNA5或3突出末端转变成平末端的结构。第69页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四活性：与 T4 噬菌体 DNA 聚合酶和 Klenow DNA 聚合酶类似，但 3-5 外切活性为 Klenow 的 1000 倍。 用途： T7 噬菌体 DNA 聚合酶可替代 T4 的功能并可用于长模板的引物延伸。第70页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四修饰的T7DNA聚合酶切除了 99% 以上的 3-5 外切

34、活性 （V1）完全除去V2用于测序反应第71页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四（五）、耐热 DNA 聚合酶 在高温下有 DNA 聚合活性，来自噬高温的细菌，主要用于 PCR 反应，如 Taq DNA 聚合酶、 Vent DNA 聚合酶、 Pfu DNA 聚合酶、 Pwo DNA 聚合酶和 Tth DNA 聚合酶等 第72页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四（六）、反转录酶（Reverse transcriptase） 依赖于 RNA 的 DNA 聚合酶，也叫做RNA指导的DNA 聚合酶或反转录酶。活性：有 5-3 合成 DNA 活性来自 AMV （

35、禽成髓细胞瘤病毒）或 Mo-MLV （ 鼠白血病病毒，又称 M-MuLV） 第73页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四AMV反转录酶包含两条多肽链； 具 5-3 DNA 聚合活性 很强的 RNA 酶 H 活性（降解与DNA杂交的RNA） 在 cDNA 合成开始时，引物和 mRNA 模板杂交体可成为 RNase H 的底物，此时，模板的降解和 cDNA 的合成相竞争；反应终止时， RNase H 可在正在增长的 DNA 链近 3 端切割模板，趋向于抑制 cDNA 的产量并限制其长度。在 42 （鸡的正常体温）能有效发挥作用，能有效地拷贝较复杂的 mRNA ，但提纯过程中易被

36、内切酶污染。第74页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四M-MuLV 反转录酶 是单链多肽， 84kDa ， 其 RNase H 活性弱，有利于合成较长 cDNA。其基因工程产品纯度高。 第75页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四2 用途cDNA（complememtary DNA)克隆5突出DNA的补平和标记测序反应第76页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四3 活性5 3DNA聚合活性 RNA or DNA为模板及带3-OH的RNA或DNA引物RNaseH活性第77页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四反转录

37、酶的5-3方向的DNA聚合酶 I 活性第78页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四反转录酶的5-3方向和3- 5方向的核糖核酸外切酶活性（Rnase H)双向外切DNA-RNA杂合链中的RNA链第79页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第四节、 DNA及RNA的修饰酶末端脱氧核苷酸转移酶与同聚物加尾T4多核苷酸激酶与DNA分子5末端的标记碱性磷酸酶与DNA脱磷酸作用第80页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四一、末端转移酶（terminal transferase）来源于小牛胸腺，是一种不依赖于模板的 DNA 聚合酶 。在二价阳离子

38、存在下，末端转移酶催化 dNTP 加于 DNA 分子的 3 羟基端。 T 或 C 首选 CO2+ ； A 或 G 首选 Mg2+ 第81页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四TdT的基本特性5 p3 HOOH 3 p 5 TdTCo2+ dATP5 p3 HO AAAAAAAAAAAAAAAAAAAAA OH 3 p 5 第82页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四末端转移酶terminal transferase（TdT)第83页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四1 底物DNA 可短至 3 个核苷酸，对 3 羟基突出末端的底物作用

39、效率最高 低离子强度时， 5 突出端或平端的 DNA 也可作为底物 2 用途在 cDNA 或载体 3 末端加同聚尾用于克隆 末端标记第84页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四同聚物加尾法再生Hind III识别位点第85页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四二、T4 多核苷酸激酶 （T4 polynucleotide kinase） 是一种磷酸化酶，可将 ATP 的 -磷酸基转移至 DNA 或 RNA 的 5 末端。 分子克隆应用中呈现两种反应 ：正反应 ：将 ATP 的 -磷酸基团转移到无磷酸的 DNA 5 端。 用于对缺乏 5-磷酸的 DNA 进行

40、磷酸化 ,催化5突出末端磷酸化速度比平末端或5末端磷酸化速度快得多。交换反应：在过量 ADP和-32PATP 存在的情况下，该激酶可将磷酸化的 5 端磷酸转移给 ADP ，然后 DNA 从 ATP 中 -磷酸而重新磷酸化。 使用的 ATP 均为放射性同位素标记 - -32pATP ，那么反应的产物都变成末端获得放射性标记的 DNA 。第86页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第87页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四T4多核苷酸激酶的交换活性第88页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四三、碱性磷酸酶（alkaline phosph

41、atase） 主要来源于:牛小肠碱性磷酸酶（Calf intestinal alkaline phosphatase），简称 CIP 或 CIAP 细菌的碱性磷酸酶（Bacterial alkaline phosphatase, BAP）第89页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四作用催化除去 DNA 或 RNA 5 磷酸的反应 用于防止 DNA 片段自身连接，或标记（5 端）前除 DNA 或 RNA 5 磷酸 第90页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第91页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第92页，共107页，2022年，5

42、月20日，5点52分，星期四第四节 其它酶一、依赖于 DNA 的 RNA 聚合酶 （DNA dependent RNA polymerase） SP6 噬菌体 RNA 聚合酶（来源于感染鼠伤寒沙门氏菌 LT2 菌株） T4 或 T7 噬菌体 RNA 聚合酶（来源于噬菌体感染的大肠杆菌）。 第93页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四1活性 这些 RNA 聚合酶实际上为转录中的 RNA 合成酶，识别 DNA 中各自特异的启动子序列，并沿此 dsDNA 模板起始 RNA 的合成。它与 DNA 聚合酶不同，无需引物，但需识别特异性位点。2用途 体外合成 RNA 分子。 用于表达外

43、源基因。第94页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四二、核酸外切酶 （nuclease）单链外切核酸酶 大肠杆菌外切核酸酶I和VII：两头降解，产生2-25bp寡核苷酸片段双链外切核酸酶大肠杆菌外切核酸酶III:双链DNA从3OH末端开始降解，释放5单核苷酸从 dsDNA 3-OH 逐一去除单核苷酸的反应，底物为 dsDNA 或线状和带切口或缺口的环状 DNA ，反应结果是在 dsDNA 上产生长长的单链区。该酶还有对无嘌呤 DNA 特异性内切核酸酶活性、 RNase H 活性和 3-磷酸酶活性（去磷酸）。不降解核酸内的磷酸二酯键，也不降解单链 DNA 及带 3 突出的 d

44、sDNA 。 持续作用能力不强，产物为切割程度不相上下的群体，有利于分离长短不等的 DNA 。第95页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四第96页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四三 单链核酸内切酶1BAL31 核酸酶（BAL31 nuclease）来源于交替单胞菌（Alteromonas espejiana）BAL31 主要活性为单链特异的核酸内切酶活性,从3羟基末端迅速降解DNA 依赖 Ca+ ,而且 EGTA(乙二醇-双-(2-氨基乙基)四乙酸） 可抑制其活性。双链的核酸外切酶活性：可从线性 DNA 两条链的 两端迅速去除单核苷酸第97页，共107页，2022年，5月20日，5点52分，星期四用途从两头缩短 DNA ，用于构建嵌套缺失体 制作 DNA 限制酶切图;确定 DNA 二级结构从单链 RNA 上去除核苷酸。 第98页