第七课样品的全息制备

1、第七课样品的全息制备第1页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日 蛋白质样品制备是蛋白质组研究的第一步，无论后续采用怎样的分离或鉴定手段，样品制备都是关键步骤。从蛋白质组大规模研究的角度而言，要求样品制备尽可能获得所有的蛋白质，但由于蛋白质种类多、丰度不一和物化特性多样等，要达到真正的全息制备是有难度的。当然，样品制备的方法还必须与后续的分离或鉴定方法相匹配，如采用双向凝胶电泳，需谨慎使用SDS抽提蛋白质，如果以液相色谱作为分离手段，太多的去污剂和两性电解质不是一个好的选择。 更重要的是，样品的来源千差万别，针对不同来源的样品(如细胞样品、动物组织样品、植物样品、体液等)，需要

2、采取不同的蛋白质抽提方法。本章就常规样品的制备和不同来源蛋白质的样品制备进行详细阐述。第2页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日实验室一般使用下列三种方法制备质粒DNA： 氯化铯密度梯度离心法 质粒DNA纯度高、周期长、设备要求高。 碱溶法 质粒DNA纯度低、快速、操作简便。 沸水浴法 质粒DNA纯度、操作周期介于氯化铯法和碱溶法之间。第3页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日质粒DNA的分离纯化 碱溶法： 用含有EDTA的缓冲液悬浮菌体； 加溶菌酶裂解细菌细胞壁； 加NaOH和SDS的混合溶液，去膜释放内含物； 加高浓度的醋酸钾溶液，沉淀染色体，去除染色体

3、DNA及大部分蛋白质； 离心取上清液，用苯酚-氯仿萃取，去除痕量的蛋白质； 乙醇或异丙醇沉淀水相质粒DNA ； 用无DNase的RNase去除残余的RNA；第4页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日第一节 双向凝胶电泳常规样品制备及其改进 一、概 述 目前蛋白质组研究技术发展很快，新的研究方法和研究手段不断涌现，如毛细管等电聚焦、多维色谱、分子扫描仪和微流芯片等。而双向凝胶电泳(two-dimensional gel electrophoresis)技术是蛋白质组研究中最早的支撑技术之一。由于双向凝胶电泳技术具有高分辨率、高重复性、微量分析和制备等性能，仍然是当今蛋白质组分析

4、研究中的一个强有力的工具。因而针对双向凝胶电泳样品制备方法的探索也是蛋白质组研究的一个重要方面。 所以，在样品制备过程中，一切影响等电聚焦和凝胶电泳的因素都应该考虑在内。样品制备绝对是一门艺术，方法可以从简单的缓冲液溶解，到应用离液剂、还原剂及去污剂来进行复合物提取，以及到更复杂的顺序提取(sequence extracting)和亚细胞分级等。由于实验需求的不同以及样品本身的特殊性，没有一种样品制备方法能够广泛地适用于各种各样的样品。所以，对于每一个有着不同要求的样品，都需要通过大量的实验来摸索最合适的实验条件。有效的可重复的样品制备方法是双向凝胶电泳成功的关键。第5页，共78页，2022年

5、，5月20日，9点59分，星期日一般来说，一种理想的有效的样品制备方法应该满足以下几点要求。 在合适盐浓度下，可重复地溶解所有的蛋白质，包括疏水性蛋白质，并使样品中的蛋白质以分离的多肽链形式存在。避免溶解性低的蛋白质(如膜蛋白)在等电聚焦时由于溶解度降低而沉淀析出。 防止蛋白质的化学修饰，包括蛋白质降解、蛋白酶或尿素热分解后所引起的修饰。排除核酸、多糖、脂类和其他干扰分子。获得的目标蛋白质应在可探测水平，有时需要去除高丰度蛋白质和不相关蛋白质。第6页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日二、样品裂解液中各种成分分析 为获得最佳的双向电泳分离结果，样品一般使用促溶剂、去污剂、还原

6、剂、IPG缓冲液和两性电解质等将其变性并充分溶解。然而这些化学物质应满足一些化学和电学要求，如适合IPG胶条的IEF技术、保持蛋白质最大的溶解性和尽可能低的离子强度(等电聚焦加以高电压时，低离子强度使得电流很低，保证了聚焦的快速和高效)。第7页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(一)离液剂 尿素是最常用的离液剂(chaotropic agent)，它的主要作用是改变或破坏氢键等次级键的结构，使得蛋白质变性并使蛋白酶失活。硫脲和尿素联合使用，可以大大增加蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性。尿素和硫脲有效地破坏了疏水键，防止了聚集作用和二级结构的形成，聚集作用和二级结构的形成

7、会改变蛋白质的迁移性。然而硫脲在水中的溶解性很差，需要高浓度的尿素来助溶，因此在实际应用中，需要高溶解强度时，一般用2molL硫脲和58molL尿素联合使用。第8页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(二)还原剂 还原剂(reducing agent)主要是用来断裂蛋白质分子中Cys残基之间形成的二硫键，增加蛋白质的溶解性。常用的还原剂有巯基乙醇、DTT或DTE(Dithioerythreit01)和三丁基膦(TBP)等。其中DTT是使用比较广泛的还原剂，它在50mmolL时能有效地还原大部分的二硫键，但有些蛋白质仍不能完全被还原。但是如果过分提高DTT的浓度，由于它的pKa

8、在8左右，因而会影响到pH梯度。另外，DTT在碱性pH值下会发生去质子化，在等电聚焦时，向阳极发生迁移，使得阴极的DTT损耗而不足，导致二硫键复原，蛋白质沉淀。而非离子型还原剂TBP则比DTT更加有效，能大大增加蛋白质的溶解性，在低摩尔浓度下就能使蛋白质得以还原。第9页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(三)去污剂 去污剂的作用主要是破坏蛋白质分子之间的疏水相互作用，提高蛋白质的溶解性，防止在等电聚焦时析出。去污剂有离子型、非离子型和兼性离子型等几类。经常使用的去污剂有阴离子去污剂SDS，非离子去污剂TritonX-100和NP-40，两性离子去污剂CHAPS等。原则上去污

9、剂应该是非离子型或者是兼性离子型，这样才不会影响蛋白质迁移到它们各自的等电点位置。离子型去污剂如SDS不利于等电聚焦，然而由于SDS的缓冲液可抑制蛋白质被内源性蛋白水解酶降解，并提高了蛋白质的溶解性，特别是膜蛋白的溶解性，因此一般只用于样品处理的初级阶段。在SDS浓度不高于0.3时，对等电聚焦不会产生太大的影响。现多数以兼性离子去污剂CHAPS代替。CHAPS比其他去污剂溶解疏水性氨基酸残基的能力更强，其使用浓度一般在12。然而它在高浓度脲中的溶解度比较低，因此不断有新的去污剂涌现出来。第10页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(四)两性电解质载体 在去污剂存在的情况下，某

10、些蛋白质在等电聚焦的时候仍旧容易沉淀在它们的等电点上。为了防止这种现象的出现需要向蛋白质溶液中加入某些盐类以增加蛋白质溶解度，但是与此同时这些盐类又会使聚焦效果不理想。为了解决这个问题，通常在缓冲液中加入两性电解质作为载体。两性电解质能够促进蛋白质的溶解，吸附高浓度尿素在溶液中形成的氰酸盐离子(cyanateions)，离心时还有助于核酸的沉淀。此外，它还可以阻止样品蛋白质和IPG胶条中固相化的两性电解质相互作用。一定浓度的两性电解质会提高蛋白质溶解性，在第一向等电聚焦时，提高极性端蛋白质的聚焦效果。第11页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日 以上介绍的是常规使用的各种裂解

11、液成分对样品蛋白质的作用，保证蛋白质达到最大的溶解度并适合双向凝胶电泳。关于裂解液的配方，由于不同实验室有着不同的习惯和需求，配方也千差万别。Gorg总结了三种裂解液的配方：9mol/L脲，1(m/V)DTT，2-4(m/V) CHAPS，2(V/V)两性电解质，pH3-10和10mmol/L Pefabloc蛋白酶抑制剂。7mol/L脲，2mol/L硫脲，1(m/V)DTIT，24(m/V)CHAPS，2(V/V)两性电解质，pH310和10mmol/L Pefabloc蛋白酶抑制剂。热的SDS缓冲液：1(m/V)SDS，100mmolLTris-HCl，pH7.0，该缓冲液裂解样品后至少3

12、倍稀释于1或2的裂解液中。 根据目标蛋白质的特性和实验要求，我们同样可以摸索出更合适的裂解液配方，进行有效重复的样品制备。第12页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日三、 双向凝胶电泳常规样品制备 样品制备时要使用新鲜的样品或者将新鲜样品速冻(液氮或70)保存；注意防止污染，佩戴乳胶手套等。整个操作过程在冷库或冰浴中进行，避免蛋白质的降解、修饰。 下面以最简单的培养细胞的样品制备为例，介绍操作步骤如下。常规细胞培养，待长至80左右密度时，在处理前一天更换新鲜培养液。吸去培养液，用预冷PBS清洗细胞，重复3次。按1 X 106细胞加50tl的量往培养皿中加裂解液(8molL U

13、rea，4CHAPS，40mmolLTris，65mmolLDTT)，刮刀收集。进行超声波处理，处理时间为5s，间歇时间为10s，功率为100120W，超声处理至溶液清澈无黏稠物为止。4、25 000g离心1h。取上清测蛋白质浓度后，分装后70冰箱中冻存。第13页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日四、蛋白质顺序提取法 由于在2-DE胶中所能显示出的蛋白质的数量，依赖于细胞中蛋白质的拷贝数、蛋白质的上样量及电泳后染色方法的灵敏度。为了能够富集低拷贝蛋白质，很多实验室采用了样品预分级的方法，如亚细胞分级、亲和分级、蛋白质复合物分级和根据蛋白质溶解性的顺序提取法等。另外，窄pH范

14、围的lPG胶条在一定意义上也可以说是富集了低拷贝蛋白质，提高了低丰度蛋白质在2-DE中的分辨率。 这里主要介绍蛋白质顺序提取法，它是根据蛋白质溶解性差异，用具有不同溶解能力的溶解液进行顺序提取，从而提高了样品在2-DE中的可检测范围。其具体操作步骤如下所述。 溶液A(40mmolLTris)提取：将细胞裂解，振荡混匀，12 000rmin离心8min，取上清，抽提出细胞中的可溶性蛋白质。 溶液B(8molL脲，4CHAPS，25mmolDTT)提取：在上一步的沉淀物中加入溶液B，振荡混匀，12 000rmin离心8min，取上清。 溶液C(5molL脲，2molL硫脲，2CHAPS，2SB31

15、0、2mmolLTBP)提取：上一步的沉淀物用溶液A洗2次，加溶液C，振荡混匀，12 000rmin离心8min，取上清。第14页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日 如有必要也可用更强烈的溶解液进行第四步提取，这样就根据蛋白质溶解性不同，提取出了不同的蛋白质组分，对疏水性很强的蛋白质如膜蛋白和低丰度的蛋白质起了富集作用。顺序提取法是目前获得更多蛋白质点的一种良好策略。，应用双向凝胶电泳分离手段，一步提取法一般只能获得10002000个不同的蛋白质点；而使用分级顺序提取方法，对不同组分进行分离，据报道能够获得上万个不同的蛋白质点。在样品量充足的情况下，先进行亚细胞器分级，然后

16、对各个分级组分再进行顺序提取，可以在一定程度上富集溶解度差及低丰度的蛋白质，尽量把细胞中的全部蛋白质提取出来。第15页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日五、注意事项 以上介绍的是双向凝胶电泳蛋白质样品制备的一些常规方法。然而这些制备方法并不是十分完善的，相信随着不断的实验探索，会有更理想的制备方法出现。但不管采用什么方法，都应该注意以下问题。在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性。因此，在样品制备过程中可选择合适的增溶试剂(如脲、硫脲等)，以减少疏水性蛋白质的损失。选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价键二硫键，使其形成一个各自多

17、肽的溶液。尽量除去核酸、多糖、脂类等于扰分子。防止蛋白质在样品处理过程中的人为修饰，制备过程应在低温下进行，以避免细胞破碎释放出的各种酶类的修饰(建议加入合适的蛋白酶抑制剂)；含有脲的试剂不要加热(温度不高于37)，避免尿素分解产生的异硫氰酸盐引起氨基甲酰化而导致电荷的不均一性；佩戴乳胶手套，减少来自头发和皮肤的角蛋白污染。裂解液新鲜配置，分装后置80冰箱中保存，注意不要反复冻融。样品建议分装成合适的量，然后冷冻干燥或者直接以液体状态置-80冰箱中保存，但要注意不要反复冻融。第16页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日第二节 培养细胞蛋白质样品的制备 在蛋白质组研究中，我们经

18、常利用细胞培养技术，观察细胞在不同生理条件下的蛋白质动态变化。下面主要介绍关于细胞破碎样品的几种制备方法。 一、细胞破碎的处理方法细胞破碎主要包括机械和化学方法两种。由于在细胞破碎时会释放出一些蛋白酶及其他引起蛋白质修饰的酶。为了避免这种情况，样品中应加蛋白酶抑制剂，同时尽量将样品直接加入强变性裂解液中，在低温及使用预冷的溶液下进行操作。根据裂解程度的不同，细胞破碎方法又可分为以下两种。 (一)温和的裂解方法裂解对象主要是一些容易裂解的细胞，如组织培养细胞、血细胞和微生物等。同时温和裂解方法可用于一些亚细胞分级产物，如线粒体、高尔基体和膜等。有时在制备样品的时候需要多种裂解方法综合使用来获得目

19、标蛋白质。如表13.1所示为温和裂解方法的应用对象和操作步骤。第17页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(二)更强烈的破碎方法 当破碎不容易破碎的细胞如固体组织中的细胞或有坚韧细胞壁的细胞时，需要采用更强烈的破碎方法对细胞进行破碎裂解。这些方法可使细胞完全破碎裂解，但在操作过程中应避免产热及产生泡沫。主要的方法如表13.2所示。第18页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日二、培养细胞总蛋白质的提取 裂解液裂解方法是很多实验室常用的裂解组织培养细胞的样品制备方法。下面就裂解液裂解方法展开讨论，以下的操作过程均在冰浴中进行。 这里所涉及的裂解液成分为：8mol

20、/L脲，65mmol/LDTT，4CHAPS，40mmol/LTris。 1胰酶酶解后裂解细胞培养在直径为10cm的培养皿中，待培养至80左右密度时，以含0.02EDTA的005胰蛋白酶消化，细胞经预冷的PBS漂洗3次，离心收集在15ml离心管中，加450l裂解液，反复吹打。 2皿上直接裂解细胞培养在直径为10cm的培养皿中，待培养至80左右密度时，细胞用预冷的PBS漂洗3次，加4501裂解液，细胞刮刀收集，用移液器转移至1.5ml离心管中，反复吹打。第19页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日3热SDS裂解 细胞培养在直径为10cm的培养皿中，待培养至80左右密度时，细胞用

21、预冷的PBS漂洗3次，加450l热的SDS裂解液(每10ml中，10SDS 300l，-巯基乙醇100l，1.5mol/L TrisHCl，pH8.8，300l，去离子水9.3ml)，细胞刮刀收集，用移液器转移至1.5ml离心管中，反复吹打后，把离心管置人液氮中迅速冷冻。在不加热情况下，真空离心冻干样品。用原来体积的样品缓冲液重新溶解样品(100ml中，尿素59.7g，NP-40 4g，DTT1.54g，两性电解质pH310 5.5g，去离子水44.9m1)。 最终所有的样品用超声细胞破碎仪超声处理，超声时间为5s，间歇时间为10s，功率为100120W，超声处理至溶液清澈无黏稠物为止，处理过

22、程在冰浴中进行。超声处理后，4、25 000g离心1h。取上清进行蛋白质浓度测量，按实验所需的量分装后80冰箱中保存备用。第20页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日 以上为贴壁培养细胞的样品制备方法，至于悬浮培养的细胞(包括植物细胞)，常规的处理方法就是离心收集细胞；用预冷PBS清洗3次；加裂解液进行处理；进行超声波处理；离心收集上清。注意无论是如何处理细胞，样品最终的蛋白质浓度不要低于0.1mg/ml，最合适的浓度为15mg/ml(一般来说1X107个动物细胞能得到lmg蛋白质)。因为样品浓度过小，会使相对盐浓度增大，从而影响了等电聚焦。第21页，共78页，2022年，5

23、月20日，9点59分，星期日第三节 组织样品制备 一、概 述 以疾病组织为实验材料的蛋白质组学研究，因为真实地反映机体内环境的情况，既可以为疾病的早期诊断提供新的特异性的候选标志，又能够为疫苗的研制寻找新的特异性的候选抗原，同时可以监测、跟踪疾病的发展及预后情况，并为认识发病机制、明确疾病的分型、分级、分期提供线索。因此，疾病组织的蛋白质组学研究有着不可替代的临床意义及应用前景。 另外，由于水稻和拟南芥这些植物基因组序列测定的完成，随之而来的问题是如何应用高通量的技术去研究其复杂的蛋白质网络。因此植物蛋白质组研究也越来越受到关注，对农业生产必将会产生巨大的影响，如现在的育种也将从以前的通过个别

24、基因的转移来改进个别性能，发展到整体性能的改善。植物蛋白质组的研究在以农业为本的国家里，有着更丰富的内涵。然而由于动物组织与植物组织虽然同是组织样品，但是各有其物化特性，所以制备方法也不尽相同。有些制备方法可以借鉴通用，有些则必须根据其特有的性质和要求做相应的改变。第22页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日二、动物组织样品的制备 对于取材于机体组织样品的制备，不均一性和易污染性一直是技术发展的症结所在。如何从多细胞、不均一的体系中获取特定类型的细胞、亚细胞结构甚至特殊的蛋白质复合体，同时又避免各种血浆蛋白质、基质组分以及坏死组织成分的污染，是各类组织样品制备方法必须考虑的问

25、题。 早期组织样品采用酶解样品制备法(enzymatm sample preparation，ESP)，即酶解、抽提细胞然后以Percoll梯度离心等方法分离。由于酶解处理会导致蛋白质图谱的改变，ESP已很少使用。目前，动物组织样品常采用非酶解样品制备法、纯化法和微切割法进行制备。第23页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(一)非酶解样品制备法(nonenzymatic sample preparation，NESP)2试剂RPM11640缓冲液PercollPBS溶液，DNase I溶液，RNase A溶液，上样缓冲液第24页，共78页，2022年，5月20日，9点59分

26、，星期日3操作步骤 (1)细胞的提取 手术切除的组织块迅速置于冰上，快速切成几个肉眼可见、无坏死区域的小块(备份的原材料可用于平行的组织病理学、细胞学、免疫组化等实验)。用预冷的RPM11640缓冲液洗涤组织小块数次，根据组织病理学特征及组织块的大小+选择合适的细胞提取方法。压挤(squeezed)：在约0.5ml预冷的RPM11640缓冲液中，通过切、压、剁得到微小的碎片，添加缓冲液至12ml。刮擦(scraped)：以锋利的解剖刀刀锋轻刮新鲜切出的组织小块的截面，所得细胞置于12ml预冷的RPM11640缓冲液中。针头吸取(NeedleAspiration)：用07mmolL孔径的针头，收

27、集约1 000万个细胞于12ml预冷的RPM11640缓冲液中。第25页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(2)去除组织碎片及红细胞先以两层直径10mm的尼龙网眼过滤器重悬细胞。尼龙网眼过滤器上层孔径为250m，下层孔径为100m(可根据组织细胞的实际大小选择合适的上下滤器孔径)。这一步对以刮擦法或压挤法提取的细胞悬液尤其重要，因为其中不可避免地混有黏连组织和成纤维细胞等杂质成分。所得的细胞重悬液用1.2mm的长针头(连在2ml注射器上)转移至新的Effendorf管中，小心加入1.01.5ml预冷的PercollPBS溶液，使得重悬细胞浸没其中。于4，在低加减速率下(1

28、000g)离心10min。第26页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日 (3)收集并洗涤细胞 用连在2ml注射器上0.7mm的针头挑取收集分界面处的细胞层，注意尽量减少Percoll及RPM11640缓冲液的污染。根据细胞的多少用适当体积的预冷的PercollPBS溶液洗涤。若细胞层薄甚至几乎透明，洗涤后的细胞收集在体积小于0.4ml的PBSPIH溶液中，在盛入1.5ml预先称重的Effendorf管中，加满PBSPIH溶液后，4、800g离心3min，沉淀物中的细胞颗粒重悬于PBS溶液中。若细胞层较厚，洗涤后的细胞收集在体积小于lml的PBSPIH溶液中，然后转移人1012

29、ml的玻璃离心管中，加入56ml预冷的PBSPIH溶液后，4 、800g离心3min，沉淀物中的细胞颗粒重悬于12个盛有预冷的PBS溶液并预先称重的Effendorf管中。于4 、2 700g离心5min，小心去除所有的上清及Effendorf管内外管壁黏着的液滴。称重并计算所得细胞的净重(wetweight，WW)后80冻存。第27页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(4)细胞裂解及核酸降解按细胞净重(mg)：mQ水(l)=1:1.89的比例，在冻存细胞中加入相应体积的mQ水，冰上制成细胞重悬液。反复冻融4次以破碎细胞。 依次加入(0.089XWW)l10SDS/33.3

30、Mercapthoethanol，(0.329XWW) l DNaseI溶液和RNaseA溶液，冰上静置5min。 冷冻干燥降解核酸后的样品。 冻干的蛋白质样品溶解在(6XWW，或3XWV若WW10mg)Pl适当的上样缓冲液中，混匀后静置3h使样品中的蛋白质充分溶解(有文献报道只需5min即可)。4 12 000rmin离心15rain，上清小心转移入新的Effendorf管中，80冻存。第28页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(二)纯化法 由于方法所限，NESP法制备的组织样品，无法完全去除血浆蛋白质、基质组分以及坏死组织成分的污染，而且也不能排除机体组织中其他类型细胞

31、的干扰。因此，在用 NESP法制备成细胞悬液后，常常添加抗体纯化、流式细胞仪纯化或选择性的细胞培养建立不同的细胞株系。但纯化出单一类型的细胞有可能会丢失一些系统性信息，例如，细胞 间基质与细胞间、不同类型细胞间的相互作用等信息。据报道，不经流式细胞仪纯化，仅用NESP法制备的组织样品中基质信息仍可以保留，因此，应注意根据具体情况设计对照和并行实验。第29页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日1抗体纯化法(antibody purification)2流式细胞仪纯化法 3建立细胞株系法第30页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日 流式细胞仪就是进行流式细胞分析

32、的仪器，它集电子技术、计算机技术、激光技术、流体理论于一体，是一种非常先进的检测仪器。第31页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪的特点单个细胞分析同时多参数分析速度快：10000个细胞/秒统计学意义：提供细胞群体的均值和分布情况分选感兴趣的细胞第32页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪的原理流式细胞仪的应用流式细胞仪的数据处理第33页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪仪器结构液流系统光学系统激光光源光收集系统电子系统光电转换数据处理系统第34页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日原理：

33、细胞被戴上特殊的标记。所用的标记细胞的探针是能够同待分选细胞表面特征性蛋白(抗原)结合的抗体，而这种抗体又能够同某种荧光染料结合。被结合的细胞带上了荧光标记。当稀释的细胞进入超声波振荡器时，极稀的细胞悬浮液形成很小的液滴，一个液滴中只含有一个细胞。液滴一旦形成并通过激光束时，激光束激发结合在细胞表面抗体分子。第35页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日Injector TipFluorescencesignalsFocused laserbeamSheath fluid第36页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日荧光染料及其发射波长FITC 525nmPE

34、575nmPI 630nm自发荧光与特异荧光第37页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日抗体的选择首选直接标记抗体荧光分子 PE最强，适用于弱表达抗原 FITC最便宜，适用于强表达抗原间接标记：一般不提倡用第38页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日实验对照的设计空白对照：ALL阴性对照：常用同型抗体对照 单色分析：设同型抗体对照 多色分析：同型对照，单阳性对照（用于仪器校正）阳性对照：检测阴性时第39页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日实验标本的处理单细胞悬液的制备：胰酶消化抗体或标记分子的染色：抗原抗体反应非特异结合的去除：洗涤和封闭

35、 封闭：血清和同型抗体第40页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪的样品要求单细胞悬液被检细胞或颗粒大小0.280um样品中至少20000个细胞，浓度105-107个/毫升第41页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪的光学系统激光 (Laser)是一种相干光源，它能提供单一波长、单一方向、同步的稳定光照激光波长: 台式机为固定波长488nm, 635nm ，大型机波长谱线宽包括 325， 457.9，488, 514.5，520.8，530.9，568.3， 633，647 nm and紫外光UV。光收集系统是由若干组透镜, 滤波片, 小

36、孔组成，将产生的光信号引导至检测器第42页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日Forward Angle Light ScatterFALS SensorLaser第43页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日90 Degree Light ScatterFALS Sensor90LS SensorLaser第44页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日LaserFluorescence DetectorsFluorescenceFALS SensorFluorescence detector(PMT3, PMT4 etc.)Purdue Un

37、iversity Cytometry Laboratories第45页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪的光学系统第46页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日 流式细胞仪通常以激光作为发光源。经过聚焦整形后的光束，垂直照射在样品流上，被荧光染色的细胞在激光束的照射下，产生散射光和激发荧光。这两种信号同时被前向光电二极管和90方向的光电倍增管接收。光散射信号在前向小角度进行检测，这种信号基本上反映了细胞体积的大小；荧光信号的接受方向与激光束垂直，经过一系列双色性反射镜和带通滤光片的分离，形成多个不同波长的荧光信号。第47页，共78页，2022年，5

38、月20日，9点59分，星期日1 流式细胞仪的散射光信号FSC:表示细胞大小SSC：表示细胞内颗粒的复杂程度第48页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日外周全血细胞散射光双参数点图（红细胞溶解后）第49页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日2，荧光信号荧光素吸收激光能量荧光素将吸收能量释放，转换为振动能和热能释放较入射光波长更长的光量子荧光素与特异抗体结合荧光抗体与细胞抗原结合越多，产生的荧光信号越强第50页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪的电子系统进行信号检测和分析：当细胞携带荧光素标记物, 通过激光照射区时, 受到激发, 产

39、生不同波长的、代表细胞内不同物质的荧光信号 荧光信号由光电接收器接收，转变为电信号，可分析电压脉冲的高度、面积和宽度电脉冲信号经A/D转换成数字信号数字信号传送到计算机，进行储存、 作图、 统计分析第51页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日 当含细胞的液滴逐个通过激光束时，受到两种检测器的检测:如果液滴中含有细胞就会激活干涉检测器(interference detector)，只有带有荧光标记细胞的液滴才会激活荧光检测器(fluorescence detector)。当带有荧光标记的液滴通过激光束时，将两种检测器同时激活，引起液滴充电信号使鞘液带上负电荷。由于液滴带有负电荷

40、，移动时就会向正极移动，进入到荧光标记细胞收集器中。细胞分选的原理第52页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪分选系统488 nm laser+-Charged PlatesSingle cells sortedinto test tubesFALS SensorFluorescence detector第53页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪的应用第54页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪的科研应用细胞表型分析胞内细胞因子的检测染色体分类研究细胞周期和DNA倍体分析流式标准小球定量分选细胞内钙离子测量第

41、55页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪的数据处理第56页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日数据处理 检测数据的显示视测量参数的不同由多种形式可供选择。单参数数据以直方图的形式表达，其X轴为测量强度，Y轴为细胞数目。对于双参数或多参数数据，既可以单独显示每个参数的直方图，也可以选择二维的三点图、等高线图、灰度图或三维立体视图。第57页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪数据分析（1）直方图分析第58页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪数据分析（2）点图分析第59页，共78页，2022年，

42、5月20日，9点59分，星期日流式细胞仪数据分析（3）等高图和密度图分析第60页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日Gating第61页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(三)微切割法1人工微切割法(manual microdissection)2激光微切割(laser microdissection)(四)其他方法1.组织芯片2.质谱成像术 第62页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日激光捕获显微切割技术（LCM）激光捕获显微切割（LCM）技术，可从所需标本不同成分中获取纯净的细胞，甚至可从同一标本的不同阶段和不同部位获取材料。目前，L

43、CM广泛用于肿瘤学、细胞发生学和其他学科的研究 第63页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日第64页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日激光捕获的原理及过程 在显微镜下，依据细胞或组织形态学特征、免疫组织化学表型，甚至由杂交技术获得的基因型，来选择感兴趣的细胞。然后，连同膜一起放入裂解液依据不同的研究目的提取DNA、RNA、酶、或者蛋白质进行分析。 第65页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日Laser Capture Microdissection 1. Prepare tissue2. Locate cells3. Place cap4

44、. Pulse laser5. Remove cap6. Extract molecules第66页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日激光扫描共聚焦显微技术激光扫描共聚焦显微镜(LSCM)是在普通荧光显微成像基础上加装了激光扫描装置，并利用计算机图形处理技术，应用紫外或可见光激发荧光探针，得到细胞或组织内部微细结构的荧光图像。 第67页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日激光共聚焦显微术的图像处理功能与应用1“细胞CT”功能：为分子细胞生物学的深入研究拓 宽了视野。2三维成像与细胞内部结构图像相结合的功能： 可以将断层图像与三维重建图像有机地相结合，能揭示

45、细胞内部的结构和提供细胞的长、宽、厚、断层面积、细胞体积等参数给人以三维立体的概念。3将形态学、生理学与分子细胞生物学的研究相互结合：利用LSCM不但可以观察细胞形态的动态变化，而且用适当的荧光探针可以观察细胞内部的生物化学变化。第68页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日WHAT IS CONFOCAL MICROSCOPYThe resolution of images obtained with conventional microscopy are seriously deteriorated by the contamination of the image pla

46、ne with out-of-focus lightWIDEFIELDCONFOCAL第69页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日三、植物组织样品的制备 上面提到的动物组织样品的制备方法有些对植物组织同样适用，但应根据植物组织的特点，在应用时而做相应的改进。由于植物组织含有坚韧的细胞壁和复杂的细胞外基质等，所以，在样品制备时要采用更强烈的破碎方法才能破碎细胞获得样品。对于植物材料来说，标准的蛋白质提取方案是在TCA丙酮溶液中沉淀蛋白质，然后用含去污剂的裂解液来溶解沉淀。这种方法的优点是：克服在单位质量的植物组织中蛋白质提取量低的问题；去除了植物次级代谢产物带来的影响；使植物体

47、内高活性的蛋白酶失活，避免了蛋白质被降解修饰。其缺点在于由于不充分地沉淀和溶解而选择性地丢失某些蛋白质。第70页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日(一)TCA丙酮法 简单的植物样品制备可在加裂解液的情况下，在TCA的丙酮溶液中进行匀浆破碎处理，然后离心获得。下面以拟南芥幼叶(greed leave)为例介绍，具体操作步骤：称取新鲜的嫩叶200mg，洗净。使用液氮速冻，进行研磨，加含0.07巯基乙醇，10TCA的丙酮溶液，低温研磨45min。35 000g离心15min，用0.07巯基乙醇，1mmolL PMSF和2mmolL EDTA溶液清洗沉淀，然后冻干。每10mg冻干粉

48、末中加250l样品裂解液(9molL尿素，2两性电解质pH310，60mmolLDTT，0.5TritonX100和0.003溴酚蓝)。搅拌情况下在37温浴30rain。19 000g离心15min，取上清。第71页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日四、注意事项 一般而言，无论动物组织还是植物组织，在样品制备时都必须注意以下几点。尽量使用新鲜的组织制样，如需保存，则应该迅速冷冻保存在液氮或-80低温冰箱中。使用预冷的缓冲液，整个操作过程应该在冷库或者冰浴中进行，以避免随机的物质降解。大部分的非目标组织应先切成小块并洗涤除去。使用蛋白酶抑制剂，避免蛋白质的降解和修饰。少量的核

49、酸不会引起蛋白质聚集影响等电聚焦，但是大量的样品制备时必须用核酸酶进行处理；另外也要去除多糖等干扰分子。 第72页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日第四节 分泌蛋白质样品的制备 细胞分泌蛋白质主要包括细胞因子、生长因子和激素等具有重要功能的生物活性分子。分泌蛋白质的重要性决不亚于胞内蛋白质或膜上受体蛋白质，如致病细菌的分泌蛋白质往往含有致病或毒性因子，对于疾病的病理研究和抗生素开发等具有重要意义； 真核细胞的分泌蛋白质负责细胞的自反馈调节以及细胞间的近程或远程的信号传导，在研究信号传导通路、癌细胞生长转移和免疫调节等方面具有十分重要的作用。因此，借鉴蛋白质组的重要意义和手段

50、，分泌组(secretome)这一概念也应运而生，即指一个有机体所有的分泌蛋白质。第73页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日一、真核细胞的分泌蛋白质样品制备 培养细胞的分泌蛋白质就在细胞培养液中，收集分泌蛋白质要注意两点：一是细胞需无血清培养基培养，或在血清培养基中培养至一定密度后无血清培养，以避免血清中的蛋白质混在分泌蛋白质中；二是脱盐和浓缩，由于培养液中有大量的盐，并且体积较大，分泌蛋白质相对浓度很低。通常采用分子超滤膜，将脱盐和浓缩一次完成，具体操作步骤如下所述:细胞在含血清的培养基中培养(或直接用无血清培养基培养)。待细胞密度培养至80左右时，换无血清培养基，处理6

51、h收集培养液，离心去除细胞碎片，取上清，加蛋白酶抑制剂。使用Millipore公司的15ml规格的YM-3超滤管进行超滤浓缩，降低相对盐浓度。浓缩样品经稀释后，再超滤，降低绝对盐浓度。最终浓缩样品加常规裂解液，蛋白质定量后，分装冻存。 一般而言，200ml培养液中只能提取到2mg左右的蛋白质。对体积如此之大的培养液进行超滤需要很长时间。为了防止蛋白质降解和修饰，离心超滤过程应该在4进行。第74页，共78页，2022年，5月20日，9点59分，星期日二、细菌分泌蛋白质样品制备 细菌蛋白质分泌是一个复杂的多阶段的过程，对细菌的膜和细胞壁的生物合成以及细菌的存活是必不可少的。Economou把细菌分泌途径分成三个明显的阶段，第一阶段为靶向阶段，在导航因子的帮助下，靶向细胞膜；第二阶段为穿膜阶段；第三阶段为成熟释放阶段。一般意义上获得的分泌蛋白质为成熟释放到培养液中的分泌蛋白质。下面以幽门螺杆菌分泌蛋白质样品的制备为例，介绍细菌分泌蛋白质样品的制备过程。细菌培养到一定密度后，在4下20000g离心15min。取上清，045m滤膜过滤，去除残余的细菌。每380ml滤液