分子生物学技术-第五章 核酸扩增技术

1、Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1核酸扩增技术分子生物学技术 第五章2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2主要内容第一节 聚合酶链反应技术第二节 荧光定量PCR技术第三节 其他核酸扩增技术第四节 临床基因扩增检验实验室的管理与 质量控制2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics3 聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）技术是生物技术领域中最重要的四项

2、生物技术（即细胞融合技术、分子克隆术、蛋白工程技术和基因扩增技术）之一。 由于通过体外（试管内）扩增，可以将目的基因（或靶基因）片段百万倍的放大，从而达到极大地提高核酸分子检测的灵敏度，理论上其检测的灵敏度可以达到一个细胞、甚至一个分子的水平。 第一节 聚合酶链反应技术2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics4一、聚合酶链反应技术原理Watson、Crick：DNA双螺旋结构Meselson、Stahl:半保留复制模型。Khorana：最早提出体外扩增核酸的设想Kary. B. Mullis：发明聚合酶链反应Saiki：

3、发现耐热DNA聚合酶（一）PCR技术发展简史2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics5Kary B. Mullis (1944 -)，在Cetus公司工作期间，发明了PCR。 他原本是要合成DNA引物来进行测序工作， 却常为没有足够多的模板DNA而烦恼。1983年春夏之交的一个晚上，他开车去乡下别墅的路上萌发了用两个引物（而不是一个引物）去扩增模板DNA 的想法.很少有在公司工作的科研人员得诺贝尔奖， Mullis是其中之一2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical

4、Genetics6Kary B. Mullis（1944）2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics7Mullis开车的时候, 瞬间感觉两排路灯就是DNA的两条链，自己的车和对面开来的车象是DNA聚合酶，面对面地合成着DNA， 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics8引物引物Mullis的构思DNA聚合酶DNA聚合酶特定DNA片段1983年2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Geneti

5、cs99455372022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics1094变性50-65退火XX延伸2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics11Mullis的第一个PCR实验1983年9月中旬。Mullis在反应体系中加入DNA聚合酶后在37一直保温。结果第二天在琼脂糖电泳上没有看到任何条带。于是他认识到有必要用加热来解链，每次解链后再加入DNA聚合酶进行反应，依次循环。1983年12月，他终于看到了被同位素标记的PCR条带。2022/10/10Zheji

6、ang Provincial Key Lab of Medical Genetics12PCR不只是一个方法改进Mullis的上司有句“名言”，“我们要扩增这么多DNA样品有什么用”；到了1991，Cetus公司以3亿美元的转让费将PCR相关专利转让给瑞士Hoffman LaRoche公司，并在此后的经营中又获得了数亿美元的分红；Mullis于1993年获得诺贝尔化学奖，PCR和DNA重组技术一样意义深远。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics13生物学领域几乎无处不用基因、DNA片段的克隆人工基因构建DNA序列测定基

7、因定点突变基因型（突变）检测，SNP分析，遗传背景分析生物物种鉴定，系统进化研究基因表达量研究（real-time PCR） / 基因表达谱研究（ DNA chip, SAGE）2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics14PCR仪器的变迁三个水浴锅， 用手移动 （Mullis等人当时用的）电加热块 自来水冷却 （PE，1988）电加热块 内置循环液冷却 （PE，1989）三个加热块 机械手 （Stratagene，1994）半导体制冷和加热 （MJ, PE, BioMetra, Eppendrof）温度梯度, 荧光检测

8、(如 Roche的Lightcycler)风加热Lab-on-chip式的PCR仪(所谓的芯片PCR)中国的状况1991年出现三个水浴锅+机械手的原始PCR仪（华美，复日等）现在以半导体（Peltier板）制冷式为主（杭州博日,上海天呈, 厦门安普利等）2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics15 PCR技术实际上是模拟体内DNA半保留复制过程，在模板DNA、引物和四种dNTP存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的酶促反应，由变性退火延伸三个基本反应步骤构成。 （二）PCR技术基本原理2022/10/10Zhejiang P

9、rovincial Key Lab of Medical Genetics16PCR 循环 第一步 加热变性2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics17PCR 循环- 第二步 引物与模板DNA分子退火Primer 1Primer 2535535332022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics18PCR 循环- 第三步 - 引物延伸Primer 1Primer 253553533Taq DNAPolymerase2022/10/10Zhejiang Pr

10、ovincial Key Lab of Medical Genetics19第1个 PCR 循环完成后 得到两个拷贝的靶序列2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics2030次循环后靶序列扩增的数量循环数 扩增产物量 （2n）121222243238424165253262664202201,048,576302301,073,741,8242022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics21模板DNA94变性55退火72引物延伸第二次循环模板变性退火延伸经

11、25-30次循环，目的DNA增加106-7PCR原理示意图2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics221234522557294时间（min）温度（）PCR的基本原理适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性DNA变性形成2条单链子链延伸DNA加倍2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics23PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点1234522557294时间（mi

12、n）温度（）适温延伸3高温变性1低温退火2重复13步2530轮目的DNA片段扩增100万倍以上DNA双螺旋DNA单链与引物复性子链延伸DNA加倍DNA变性形成2条单链模板DNA942022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics24PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点9555引物1引物2DNA引物2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics25PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点55引物1引物2DNA引物72Taq酶Taq酶20

13、22/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics26PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第1轮结束94第2轮开始2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics27PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点945572TaqTaqTaqTaq2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics28PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点72第2轮结束2022/10/

14、10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics29PCR的基本原理PCR反应条件PCR过程PCR的特点模板DNA第1轮扩增第2轮扩增第3轮扩增第4轮扩增第5轮扩增第6轮扩增2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics30在下一轮循环中，DNA双链再经变性、退火、延伸三步, 模板DNA数量翻一倍(假设扩增效率为100%)。如此反复循环，便可使DNA以指数形式进行扩增。每完成一个循环需24min， 23h就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。2022/10/10Zhejiang

15、Provincial Key Lab of Medical Genetics31nyny图6-2-1 图6-2-2PCR扩增效率图（三）PCR反应动力学 到达平台期（plateau）所需循环次数取决于样品中模板的拷贝数。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics32反应组成（五要素）：模板（template）引物（ primer ）DNA 聚合酶（ DNA polymerase ）dNTPPCR buffer 二、PCR反应体系及其优化（一）PCR反应动体系2022/10/10Zhejiang Provincial Key

16、 Lab of Medical Genetics331. 模板（template）DNA RNA：总RNA、mRNA、tRNA、rRNA、 病毒RNA基因组DNA质粒DNA模板就是待扩增的目的基因或其特异片段（靶序列） 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics34预扩增核酸片段两端的已知序列，决定特异。偏高：非特异产物扩增及错配，增加引物之间形成引物二聚体，产量降低。偏低：产量降低。量：0.1-0.5umol/L2. 引物（primers)引物（primers）是人工合成的一对可以分别与两条模板DNA互补结合的寡核苷酸序

17、列 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics35引物设计要求：引物长度 分布的均衡性引物二聚体及二级结构引物3端、5端的特异性引物的内部稳定性引物的特异性扩增区域的二级结构2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics36引物的长度：1530核苷酸，引物过短会影响PCR反应的特异性，引物过长会提高相应的退火温度，增加退火难度。引物的均衡性：引物中碱基组成应尽可能随机分布，避免出现嘌呤或嘧啶碱基堆积现象，两条引物应该有匹配的GC含量，GC含量一般40%60

18、%。引物的二级结构：应避免由于引物分子之间存在较多的互补碱基而形成引物二聚体。 引物设计原则2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics37引物的末端：引物的延伸从3端开始，因此3端的几个碱基与模板DNA均需严格配对，不能进行任何修饰，否则不能进行有效的延伸。引物的5末端碱基无严格限制，5末端可以被修饰。 引物的特异性：引物与非目的基因序列的同源性不超过70%，3末端不要有连续8个碱基与非目的基因序列同源。 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics38

19、量：0.5-5u /100ul 偏高：引物非特异产物的扩增 偏低：产物量降低特性：(耐高热)热稳定性:92.5、95、97.5时，半衰期分别为130min、40min、5-6min延伸效率:75-80时，150个核苷酸/s 校正功能:Taq DNA聚合酶没有3-5外切酶活性，Vent 、pfu等具有3-5外切酶活性3. DNA 聚合酶(DNA polymerase)2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics39 dNTP：包括dATP、dTTP、dGTP、dCTP。量：50-200umol/L过高：加快反应速度，还可增加碱

20、基的错误掺入率和室验成本。过低：反应速度下降，可提高实验的精确性 dNTP会络合Mg2+，当PCR需要较高浓度的dNTP时，应在反应体系中适当增加Mg2+浓度。 。4. dNTP2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics40一般组成：50mM KCl, 10-50mM Tris-Cl(室温pH8.3) ，1.5mM MgCl2 KCl 促进引物退火，浓度过高抑制Taq DNA聚合酶的活性。Tris缓冲液调节pH，使反应体系偏碱性，发挥Taq DNA聚合酶活性。Mg2+浓度：影响 Taq DNA聚合酶活性Mg2+浓度过高，反

21、应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低Taq DNA聚合酶的活性，使反应产物减少。 PCR促进剂：牛血清白蛋白、明胶、非离子去污剂（如Tween20，浓度0.05%）二甲亚砜（DMSO）5. PCR缓冲液（PCR buffer）2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics4150 ul PCR反应体系的组成样品DNA 0.11ug；正链引物（25umol/L）1.0ul；负链引物（25umol/L）1.0ul；脱氧核苷三磷酸（dNTP各2.5mmol/L）4.0ul；10PCR缓冲液 5.0ul；MgCl2（25mmo

22、l/L）3.0ul；Taq DNA聚合酶12.5u；蒸馏的去离子水补至50ul。对照：阳性对照、空白对照分别以阳性模板DNA、蒸馏的去离子水取代样品DNA。6. PCR一般方案2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics42PCR仪工作参数的设置 94 3060sec， 55 3060sec， 72 3060sec， 循环30次，最后72延伸5min。PCR产物的保存与检测 PCR产物于4保存，PCR产物检测。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics4

23、3模板引物缓冲液Mg2+三磷酸脱氧核苷酸耐热DNA聚合酶温度循环参数 变性、复性、延伸的温度与时间 循环数和扩增效率：循环数决定着扩增程度。（二）PCR反应体系的优化2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics44起始模板数量与足量产物的热循环次数起始模板DNA分子数 循环次数 5040-451.010335-401.510430-353.0105 25-30 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics45剃度PCR（TD PCRTouch-down P

24、CR） 根据引物Tm值，选定一个退火温度范围（跨越1020的温度范围，引物Tm值在这个范围之内）。在设置循环参数时，让退火温度从选定范围的最高温度开始，逐步降低退火温度（每次降低15），最后结束在选定范围的最低温度。在每一个退火温度上循环25次。热启动PCR（hot start PCR） 由于Taq DNA聚合酶在低温时仍有一定的聚合酶活性，第一轮PCR反应前的升温过程中会出现非特异产物，而降低了PCR反应的特异性。可以通过所谓的“热启动”方式克服这一问题。两种优化参数的PCR技术2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics

25、46(一) 凝胶电泳 1琼脂糖凝胶电泳法琼脂糖凝胶电操作方法简单，能对PCR产物的长度进行粗略的鉴定，是应用最广泛的检测PCR产物的方法。在电泳过程中，凝胶中的溴化乙锭(EB)嵌入DNA分子中，在紫外线照射下，EB-DNA复合物发出橙红色荧光。该法缺点是不能鉴定PCR产物的序列，而且存在溴乙锭污染。 三、 扩增产物的检测与分析PCR产物是否为目的基因的扩增产物，还是非特异扩增？2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics47 琼脂糖浓度与分离线状DNA的有效范围琼脂糖含量(%) 分离线状DNA的有效范围(kb) 0.51-3

26、0 0.70.8-12 1.00.5-10 1.20.4-7 1.50.2-3 2.00.1-22022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics48 2聚丙烯酰胺凝胶电泳法特点：分辨力高，长度仅相差1bp的DNA分子即可分开；上样量远大于琼脂糖凝胶；回收的DNA纯度高；采用银染色DNA或RNA，灵敏度高，比琼脂糖凝胶电泳中EB染色法高2-5倍，且避免EB易退色的弱点。用途：PCR扩增指纹图、多重PCR、PCR产物限制性片段长度多态性（PCR-RFLP）分析。2022/10/10Zhejiang Provincial Key La

27、b of Medical Genetics49 丙烯酰胺浓度与分离DNA分子的有效范围丙烯酰胺(%) 有效分离范围(bp) 溴酚蓝位置(bp) 二甲苯蓝位置(bp) 3.51000-2000 1004605.080-500 652608.060-400 4510012.040-200 207015.025-150 156020.05-100 12452022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics50不同的限制性核酸内切酶具有特异的DNA识别序列，突变碱基的出现有可能会改变限制酶的识别位点，使切点增多或减少，导致酶切片段的数量或

28、大小发生改变。 PCR-限制性片段长度多态性分析（polymerase chain reaction based on restriction fragment length polymorphism，PCR-RFLP）（二）PCR产物的酶切分析2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics51PCR-RFLP法： 恶性肿瘤（癌基因或抑癌基因）Ras基因限制性内切酶突变限制性内切酶2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics521点杂交（dot blot）2

29、反向点杂交（reverse dot blot）3微孔板杂交（microplate hybridization）4PCR-EIA：（RNA probe hybridization enzyme immunoassay, RPEIA）5Southern印迹杂交（Southern blot）（三）核酸探针杂交分析2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics531假阳性PCR产物是最主要的污染源。含有靶DNA序列的质粒的污染。阳性对照的污染。标本之间的交叉污染。在采集标本时，其他污染源带来的污染。Taq聚合酶中带有细菌DNA，当PC

30、R扩增片段为保守的rRNA序列时，易造成假阳性。四、常见问题原因分析与处理2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics542假阴性(1) 标本处理的原因 处理标本时，靶DNA丢失。处理标本时，杂质成分没有去除干净，带入PCR反应中抑制了Taq酶活性。标本放置不当，模板发生降解（尤其是RNA）。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics55(2) PCR试剂问题 Taq DNA聚合酶失活。Mg2+浓度过低或是没有加。(3) PCR扩增过程中的问题PCR扩增

31、仪故障。PCR扩增反应液没有加液体石蜡油。(4) PCR产物鉴定中的问题电泳时没有加溴化乙锭。电泳缓冲液和凝胶使用次数过多。凝胶浓度过低，使扩增带跑散。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics563引物二聚体 两个相同的或不同的引物分子之间有较多的碱基配对，特别是引物3端有互补区。 引物模板比例太高，可增加模板用量。 退火温度过低。 热循环次数过多。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics574非特异性PCR产物造成非特异性PCR产物的常见原因提高

32、PCR反应特异性的办法 5PCR污染及预防措施标本、操作人员、实验室的一切试剂、器材及仪器 6RNA酶的污染与预防（ RT-PCR ）（1）去除外源RNase污染（2）抑制内源性RNase的活性2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics58巢式PCR（nested PCR ） 逆转录PCR（reverse transcription-PCR，RT-PCR） 多重PCR（multiplex PCR ） 重组PCR（recombinant PCR ） 锚定PCR（anchored PCR, A-PCR） 不对称PCR（asym

33、metric PCR） 反向PCR（inverse PCR） 免疫PCR(immuno-PCR) 原位PCR (in situ PCR)定量PCR 五、PCR衍生技术2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics59巢式PCR外引物1外引物2内引物1内引物2第一次 PCR第二次 PCR2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics60逆转录PCR（RT-PCR）逆转录酶聚合酶mRNAcDNA杂化双链PCR扩增2022/10/10Zhejiang Provinc

34、ial Key Lab of Medical Genetics61用于检测特定基因序列的存在或缺失。电泳引物多重PCRPCR产物2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics62引物a引物c引物b引物d53 PCR混合，变性和复性延伸异源部分双链DNA形成5555533333333333555555PCR引物a引物d 再次 PCR5533重组PCR2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics63AgAb生物素化的DNAAg-Ab复合物DNA-连接分子复合物连

35、接分子检测PCRAg-Ab-连接分子-DNA-复合物免疫PCR2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics64原位PCR（in situ PCR） 原位PCR技术是PCR技术和原位杂交技术结合的产物。 基本过程是，先用合适的固定剂（通常为甲醛固定剂如中性甲醛）对组织或细胞进行固定，然后用蛋白酶对细胞进行通透处理，以确保PCR试剂进入细胞并同靶序列接触，最后对DNA和RNA进行细胞内原位扩增。然后进行产物分析并用显微镜观察结果。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical G

36、enetics65定量PCR（Quantitive Polymerase Chain Reaction，QPCR）广义概念上的定量PCR是指通过对PCR终产物的分析或PCR过程的监测，对PCR起始模板进行定量的技术。 指数扩增期2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics66第二节荧光定量PCR技术2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics67实时荧光定量PCR定义 在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线

37、对未知模板进行定量分析的方法 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics68常 规 PCR技术： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析 无法对起始模板准确定量，无法对扩增反应实时检测实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的分析对起始模板进行定量分析2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics692022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of

38、 Medical Genetics70定量原理介绍三个概念： 扩增曲线、荧光阈值、Ct值如何对起始模板定量？通过Ct值和标准曲线对起始模板进行定量分析2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics71扩增曲线扩增曲线图：横坐标：扩增循环数（Cycle）；纵坐标：荧光强度 每个循环进行一次荧光信号的收集荧光基团荧光检测元件2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics722022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medic

39、al Genetics73荧光信号阈值 （threshold ）： 前15个循环信号作为荧光本底信号（baseline），即样本的荧光背景值和阴性对照的荧光值 荧光域值的缺省设置是315个循环的荧光信号的标准偏差的10倍真正的信号:荧光信号超过域值荧光阈值是在荧光扩增曲线上人为设定的一个值，它可以设定在荧光信号指数扩增阶段任意位置上，一般荧光域值的设置是 基线（背景）荧光信号的标准偏差的 10 倍。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics74Ct值的定义：PCR扩增过程中，扩增产物的荧光信号达到设定的阈值时所经过的扩增循

40、环次数C(t) value 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics75实时荧光定量PCR 原理 - 标准曲线 模板DNA量越多，荧光达到域值的循环数越少，即Ct值越小 Log浓度与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品可作出标准曲线，根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics76确定未知样品的 C(t)值 通过标准曲线由未知样品的C(t)值推算出其初始量Sample实时荧光定量PCR原理 绝对定量

41、252022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics77荧光定量PCR（FQ-PCR）基于荧光能量传递技术（Fluorescence resonance energy transfer FRET）,通过受体发色团之间偶极-偶极相互作用,能量从供体发色团转移到受体发色团, 转移效率与两个发色团之间距离的6次幂倒数成比例，受体荧光染料发射出的荧光讯号强度与DNA产量成正比，检测PCR过程的荧光讯号便可得知靶序列初始浓度。在PCR反应体系中，FQ-PCR的荧光标记物可分为两种：荧光染料标记和荧光探针标记。2022/10/10Zheji

42、ang Provincial Key Lab of Medical Genetics78一、荧光染料法 SYBR荧光染料 能特异性地掺入DNA双链，发出荧光信号，而不掺入链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号，从而保证荧光信号的增加与PCR产物的增加完全同步。 此方法未使用目的特异性探针，其特异性完全由引物决定。在有非特异双链DNA产生时，其荧光也同样增强，此法与常规PCR的特异性差别不大。 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics79 SYBR Green 能结合到双链DNA的小沟部位 SYBR Green 只有和

43、双链DNA结合后才发荧光 变性时，DNA双链分开，无荧光 复性和延伸时，形成双链DNA， SYBR Green 发荧光，在此阶段采集荧光信号。SYBR Green 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics80图6-10 SYBR-Green I荧光染料原理示意图53激发53SG发射SGSGSGSG5353激发SGSGSG发射SGSG不掺入双链中的SYBR染料分子不会发出任何荧光信号 SYBR荧光染料特异性地掺入DNA双链,发出荧光信号2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Med

44、ical Genetics81SYBR Green 法优缺点 对DNA模板没有选择性 -适用于任何DNA 使用方便 -不必设计复杂探针 非常灵敏 便宜优 点 容易与非特异性双链DNA结合，产生假阳性,但可以通过融解曲线的分析，优化反应条件 对引物特异性要求较高缺 点2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics821Taqman技术 二、荧光探针法与目标序列互补 5端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R所发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无

45、荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 53外切核酸酶活性，可水解探针2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics83TaqMan技术原理示意图3端的荧光Q分子吸收5端荧光R分子的荧光信号 探针5端连接的荧光R分子被Taq酶切割下来 荧光R分子发出荧光,切割的荧光分子数与PCR数量成比例 5353QRQ53R53激发5353激发RQ引物Taq 酶2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics84TaqMan法优缺点 对目标序列的高特异性 -阴性结果确定 设计

46、相对简单 -与目标序列某一区域互补重复性比较好优 点 只适合一个特定的目标 委托公司标记，价格较高 不易找到本底低的探针缺 点2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics85在Taqman探针的基础上，出现了一系列的技术进展。双探针技术的特点是将荧光分子和淬灭分子分别标记在两个不同的探针上，产生发光探针和淬灭探针。杂交时两探针的荧光分子和淬灭分子紧密相邻，从而发生FRET使荧光淬灭。荧光淬灭的程度与起始模板的量成正比，以此可进行PCR定量分析。最近广泛应用的另外一个新技术就是TaqMan-小沟结合物（minor groove

47、 binder，MGB）探针。 Taqman技术的延伸2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics86双探针技术原理示意图荧光淬灭的程度与起始模板数的量成正比 RQXQ 淬灭探针 R 发光探针2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics87TaqMan-MGB探针示意图 MGB:Minor Groove Binder(Tm enhancer)MGBQRMGB探针的3端采用了非荧光性的淬灭基因淬灭基团吸收报告基团的能量后并不发光，大大降低了本底信号的干扰。M

48、GB探针的3端还连接了一个二氢环化吲哚卟啉-三肽，可以大大稳定探针与模板的杂交，升高探针Tm 值，使较短的探针同样能达到较高的Tm 值而短探针的荧光报告基团和淬灭基团的距离更近，淬灭效果更好，荧光背景更低。2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics88亦称分子灯塔法，是一段荧光标记的单链寡核苷酸探针，其链由两部分组成，一部分是能与靶基因碱基序列互补的寡核苷酸序列，是检测靶基因的部分，位于探针的中间位置，探针形成后构成探针的环部，另一部分是分别在5和3端的荧光标记物质和荧光淬灭剂。5和3端有几个互补的碱基存在，因而可形成两端

49、反转配对，构成探针的茎部。在游离状态下，分子灯塔形成茎环发夹结构,使荧光剂和淬灭剂紧密接触，导致荧光淬灭，此时茎环结构的分子灯塔发出的荧光检测不到。2Molecularbeacon技术2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics89RQX激发RQQR激发发射分子灯塔形成茎环发夹结构,使荧光剂和淬灭剂紧密接触,导致荧光淬灭 单链寡核苷酸探针由于与靶基因碱基序列互补而与之杂交探针5和3端分离,淬灭剂对荧光剂的淬灭作用消失,产生荧光 Molecularbeacon技术 原理示意图2022/10/10Zhejiang Provinc

50、ial Key Lab of Medical Genetics90该法的基本原理是首先合成两个探针，一是荧光探针（25bp），5端接一荧光分子，另一为淬灭探针（15bp），3端接一淬灭分子，淬灭探针能与荧光探针5端杂交。当两探针结合时，荧光探针发出的荧光被淬灭探针吸收，溶液中没有荧光产生，但两探针分离时，荧光探针发出的荧光不再被淬灭探针吸收，溶液中即可检测到荧光。当PCR扩增时溶液中无模板时，两种探针特异性结合，溶液中无荧光产生；当溶液中有模板时，在较高温度下荧光探针优先与模板结合，从而使两探针分离产生荧光，荧光强度与溶液中模板数量成正比，因此，可进行PCR定量。3复合探针法2022/10/1

51、0Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics91Q淬 灭 XQ 淬灭探针 R 发光探针RR复合探针法原理示意图2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics92四、FQ-PCR的应用前景 三、FQ-PCR测定的数据处理 2022/10/10Zhejiang Provincial Key Lab of Medical Genetics93第三节、其他核酸扩增技术（一）核酸序列依赖性扩增（nucleic acid sequence-based amplification，NASBA）核酸序列依赖性扩增，又称自