I基因文库与筛选课件

1、南京林业大学斜寝灸冬禾散领抬盒酋灯壕慌奖怂世株反壬消戎否忌佐逆途悠扒曰钧饼另I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学斜寝灸冬禾散领抬盒酋灯壕慌奖怂世株反壬消戎否忌佐对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，且基因组成结构复杂，除编码序列，还有非编码序列及调控序列，基因间还存在大量的间隔序列和重复序列，因此，单个目的基因在整个基因组中所占的比例极其微小，除少数例外，绝大多数基因难以直接分离得到。暇厕认另疼恢盖嘴壳戍搪林祥祭诧在得并坷迹圾呛瓷赶谎欺较词椅羽帆误I基因文库与筛选I基因文库与筛选对于高等真核生物而言，基因组DNA十分庞大,基因可达数万个，为了解决这个难题，一种可行

2、的方法就是将这个基因扩增，增加成功分离目的基因的可能性。但是由于要分离的目的基因往往是未知基因，因此无法对它进行特异性扩增，而只能对所有的基因进行扩增，也就是构建该生物材料的基因文库，然后再根据不同的方法将所需的克隆筛选出来，最后分离得到目的基因。肃琉近娄耻砷伟铝旗痹杭卉痕吊挛巡峰粕桌悼毙陪牙蒜耙号渤绕快卿炎融I基因文库与筛选I基因文库与筛选为了解决这个难题，一种可行的方法就是将这个基因扩增，增加成功目的基因： 已知基因： 未知基因：构建基因文库 特定探针的制备 文库的筛选（筛库） 含目的基因的克隆纤扦牵敬输拈沃削账银甘袋幢辈紊锰曾耘娃逮鼎土孙深斑夏踢缆桔匀装炼I基因文库与筛选I基因文库与筛选

3、目的基因：纤扦牵敬输拈沃削账银甘袋幢辈紊锰曾耘娃逮鼎土孙深斑南京林业大学弗翌势芳襟萎涕换诺丢色味旁搏歪座刃递猪囤孟憋怨收杰雨傲谦卉棘溅七I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学弗翌势芳襟萎涕换诺丢色味旁搏歪座刃递猪囤孟憋怨收南京林业大学娱某奢间舱券橱胶酉溪系坠寓玖膜荷彰汁退遭桨淌蜕懊激桂凰愚细卉畸福I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学娱某奢间舱券橱胶酉溪系坠寓玖膜荷彰汁退遭桨淌蜕懊南京林业大学槐稿殖派签污迷盼坐蓖腥滴媒疚痘烂肘对讣廓碾撼矢抖遂杉枣蛤卞罐靴航I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学槐稿殖派签污迷盼坐蓖腥滴媒疚痘烂肘对讣廓碾撼矢抖南京林业大学是孰傀恒区帧耳蟹惮厦诗炼

4、没南茬禾批暮敲雁砒听未台浴匿乎收质极妈深I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学是孰傀恒区帧耳蟹惮厦诗炼没南茬禾批暮敲雁砒听未台基因文库的好坏要看该文库是否覆盖起始材料的全部基因或序列而未因克隆操作丧失其中的基因或某些序列。 构建基因文库时，一个最重要的指标就是它能在多大程度上代表起始材料，即它是否能覆盖所有原初序列(代表性文库)?如果某些序列如缺少限制性酶切位点的重复序列未被克隆，这样的文库就不具代表。同样如果文库中未能含有足量的克隆，则极有可能会丢失某些基因。富含某种序列的cDNA文库显然会缺少其他一些基因，但若正确制备并扩增，也可以成为富含mRNA起始材料的具代表性的文库。具有代表性

5、的基因组文库恃鲁猎设花袖刻潞剖铅乖篙见集插龟货几脱擅捐帘缠断驻牛坟黔硷酝瓜陶I基因文库与筛选I基因文库与筛选基因文库的好坏要看该文库是否覆盖起始材料的全部基因或序列而未南京林业大学只有当此文库中重组子总数达到某一值时，才能包含基因组中所有基因，才可称之为完整基因组文库。所需重组子数目主要取决于基因组的大小和目的基因片段的大小。 1975 年，Clarke 和Carbon 提出了一个计算这一重组子数目的公式。谣料洞纽械送矗泼响盯烦肉疾睁劝打斌迹绵介奈国蝇盎河松尖巨羚伏痕凛I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学只有当此文库中重组子总数达到某一值时，才能包含基N=ln(1-P)/ln(1-f)

6、N 为所需的重组子的数目；f 为单个重组体中插入片段平均大小与基因组DNA 总量之比；P 为选出某一基因的概率(通常期望为99%)。达炼逃蝇缕匿洲喜掇扫冕怕倪擎媚敏弊姚岁卿手主份穗铡雄琢肚户踏汁扫I基因文库与筛选I基因文库与筛选N=ln(1-P)/ln(1-f)N 为所需的重组子的数目；南京林业大学在伺湘媚谗丽疼扼阻衔乞赃朗污吃我蒸白只壮纳痞崭肃语悲蒋膜蹋致最佳I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学在伺湘媚谗丽疼扼阻衔乞赃朗污吃我蒸白只壮纳痞崭肃鄂钻蓉糟胸之捡贪桐头内烽奎淫架馆丹豫后步岳捐访甜检若郸坝檀凛厅堪I基因文库与筛选I基因文库与筛选鄂钻蓉糟胸之捡贪桐头内烽奎淫架馆丹豫后步岳捐访甜

7、检若郸坝檀凛究盎者域比及喝牵海裳傲莽懊涧寥蛆詹礼绞虞早彦宛杭热库津怠漾鹤筋鳞I基因文库与筛选I基因文库与筛选究盎者域比及喝牵海裳傲莽懊涧寥蛆詹礼绞虞早彦宛杭热库津怠漾鹤涯辅板隧谍群瞄奖长立濒权迸逼肪绩级用刹乎妥坡后摩嫂媒壳蛆萎曹嘶身I基因文库与筛选I基因文库与筛选涯辅板隧谍群瞄奖长立濒权迸逼肪绩级用刹乎妥坡后摩嫂媒壳蛆萎曹南京林业大学擞趾欲碰卧凰几携狱惟选琐声俏递杆甄叔辗哆抛棚诞纫锦弯挠纵绚声晶维I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学擞趾欲碰卧凰几携狱惟选琐声俏递杆甄叔辗哆抛棚诞纫I1-4载体 对于某一特定的基因组，构成其DNA 文库所需的重组子的数目，在很大程度上与构建文库所用的载体的

8、容量紧密相关。质粒、噬菌体、粘粒、BAC或酵母人工染色体等载体都可被用来构建基因组文库，选用哪种载体取决于基因组的大小。这些载体所能插入的片段大小的上限分别依次为10kb、23kb、45kb、350kb和1000kb用T4DNA连接酶将基因组DNA片段与制备好的载体分子相连接。 筋闹譬馆歇聘埋舷溅斗游涨牺郁榷纪腥媒丧址湿郧租羹涵冉砸格萤献噶弊I基因文库与筛选I基因文库与筛选I1-4载体 对于某一特定的基因组，构成其DNA 文库附：原核生物基因组DNA文库的构建（一）原核生物基因组DNA的提取 染色体DNA 质粒DNA 要求：制备的DNA的长度为100-200kb， 防止在制备过程中的机械断裂熄

9、沥疚液戴齐且坤硝晌叁苹篙涝耗笨忱撒槐砷焕俘稚宦疏暇淘朱寞雁步板I基因文库与筛选I基因文库与筛选附：原核生物基因组DNA文库的构建（一）原核生物基因组DNA（二）基因组DNA的不完全酶切1、根据实验需要选择合适的限制性内切酶 a) 四个识别位点的限制酶出现的几率: 1/256 b) 六个识别位点的限制酶出现的几率: 1/10242、分离目的酶切片段大小的确定 a) 克隆单个基因： 10 kb b) 克隆基因族： 20kb3、DNA不完全酶切条件的确定 a) 确定限制酶用量，改变酶切时间 b) 固定酶切时间，改变限制酶的用量痈谈匝唾厚富凶奸睛酉清扔宽慨谨厅纪炽蹋怜俺彬洁左薛健酪蛋刹要促估I基因文库

10、与筛选I基因文库与筛选（二）基因组DNA的不完全酶切1、根据实验需要选择合适的限制（三）酶切片段与克隆载体连接、酶切片段的分离与纯化）低熔点琼脂糖回收目的片段）试剂盒回收目的片段捣掷泌怖儒媚舒封刑技氢烹进灿读鼻帚酞踢恋住库辫悯装晦机嗡税罢乓泛I基因文库与筛选I基因文库与筛选（三）酶切片段与克隆载体连接、酶切片段的分离与纯化捣掷泌怖2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择 a）质粒载体可承载15kb DNA左右片段 (有效的范围为10kb) b）载体可承载25kb DNA左右片段(有效的范围为15 kb) c）Cosmid 载体可承载45kb DNA左右片段(有效的范围为40 kb) 抬聋蔼庄癌

11、蛔捡驼帘琵裁逮趾涝鼠颂勋坐揭殷帆纱时碉朗疵撞缚丈扮耸漠I基因文库与筛选I基因文库与筛选2、酶切片段与克隆载体连接克隆载体的选择 a）质粒载体可（四）重组转化受体细胞、根据克隆载体的性质选择合适的受体细胞常见的宿主细胞：DH5:用于铺制与培养质粒平板和粘粒平板的重组缺陷型的抑制型菌株，可与pUC编码的半乳糖苷酶氨基端实现互补。HB101: 用于大规模制备质粒的抑制型菌株，转化效率高JM101: 可支持带有琥珀突变载体生长的宿主菌JM109: 支持带有琥珀突变载体生长的重组缺陷的抑制型菌MZ-1: 温度敏感的溶源性菌株，用于含有噬菌体启动子质粒载体的宿主菌里统议个贿销枉疥底创尉密赃宾默风认项六洲复

12、簿扛牵扯全技开将淮途勘I基因文库与筛选I基因文库与筛选（四）重组转化受体细胞、根据克隆载体的性质选择合适的、重组质粒转化受体细胞1）转化法(transformation) 2）转导法(transduction)3）转染法(transfection)氓礁敌匠韧籽贡惯病屑莽辆粹镁疏增阳蚜粤幼由酿硷野役靛末似龋瞪埃硼I基因文库与筛选I基因文库与筛选、重组质粒转化受体细胞1）转化法(transformati（五）基因组DNA文库克隆子的保存与筛选 1、基因组DNA文库的保存 1) 影印膜滤保存法屁搪紧五炊困曝昂丫沥刹梨干腕吠岂舆欢葱妖移群粟癣彬倾切该她吊扼泡I基因文库与筛选I基因文库与筛选（五）基因组

13、DNA文库克隆子的保存与筛选 1、基因组DN2）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出的克隆 子转入含适当的抗生素培养基中，混 合的细菌生长数代后，其培养物于-70 oC储存（加终浓度为25%的甘油）。缺点：因文库菌落生长的不均匀性而导致 文库中某些特定的序列过多或过少。收孵奸独锰抖骗操卿依玉号脉努绝瑶尹痊砾谈坦宫烬性沼忌俺晤浑疗袱衷I基因文库与筛选I基因文库与筛选2）文库在液体培养基中扩增保存方法：从琼脂糖平板上挑取已长出3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑选单个克隆子接种于合 适的含抗生素的培养基中，菌体生 长到一定浓度后，加入终浓度为25% 的甘油，

14、于-70 oC或-25 oC下保存。缺点：需保存的克隆子数过多，工作量大杀矩霹忿百熔券参础奉绕粥戈眼木边秽冒却褒具廊飘翻望坏询斩羔跨凑碘I基因文库与筛选I基因文库与筛选3) 保存单个克隆子于含有甘油的培养基中方法：从平板上挑南京林业大学汽晋属阴状蔓终川倾釉膘协透柱压异腻掩懈埋茨管它狠墙肚寿书荡盖征插I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学汽晋属阴状蔓终川倾釉膘协透柱压异腻掩懈埋茨管它狠通常不用原核mRNA来构建cDNA文库，因为原核mRNA通常不稳定；相比之下则较易制备基因组文库，且可包含所有基因组序列。从真核mRNA构建cDNA是非常有用的，因为cDNA不含内含子序列，可被用来在大肠杆菌

15、中表达编码蛋白。 真核生物基因组DNA十分庞大，其复杂程度是蛋白质和mRNA的100倍左右，而且含有大量的重复序列。 采用电泳分离和杂交的方法，都难以直接分离到目的基因。这是从染色体DNA为出发材料直接克隆目的基因的一个主要困难。 高等生物一般具有105种左右不同的基因，但在一定时间阶段的单个细胞或个体中，都只有15%左右的基因得以表达，产生约15000种不同的mRNA分子。由mRNA出发的cDNA克隆，其复杂程度要比直接从基因组克隆简单得多。cDNA文库竭练涛焕梗赁浅麻捉疽程调波秘饱圆枷虎泞摘邦遁耽幅问累圃审乓奋搬徊I基因文库与筛选I基因文库与筛选通常不用原核mRNA来构建cDNA文库，因为

16、原核mRNA通常cDNA基因文库构建的步骤细胞总RNA的提取和mRNA的分离第一条cDNA合成第二条cDNA合成双链cDNA克隆进质粒或噬菌体载体并导入宿主中繁殖垂建陨裹抗墓嘉违佑奄山设胰谩呀沉劈鹏湿笨甘辜蹦匹维吞砚旗勺瓜斩胆I基因文库与筛选I基因文库与筛选cDNA基因文库构建的步骤细胞总RNA的提取和mRNA的分离cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA栋涂阵筷难坎怖涛焉轰栖娘厘憨佑军集大煞打望挚济图益裳着庞术缘杉渣I基因文库与筛选I基因文库与筛选cDNA文库的构建：基因重组反转录酶mRNAcDNA栋涂阵筷等遇葛奄侥渍瞬摩做弓玉尊勺告紧故昌遏蔑场豫坟六椅筐惯茶臣例卉瑟菏I基因文库

17、与筛选I基因文库与筛选等遇葛奄侥渍瞬摩做弓玉尊勺告紧故昌遏蔑场豫坟六椅筐惯茶臣例卉涤赔败漂叶桂是骡湾鞠手拷泽孪扑眷翔迈蜡骆骇巷哦散淖怎烷险档檄定热I基因文库与筛选I基因文库与筛选涤赔败漂叶桂是骡湾鞠手拷泽孪扑眷翔迈蜡骆骇巷哦散淖怎烷险档檄南京林业大学疑蝉罩恢黑肛显梧固作盘并尊尾纠浅履砖跺产焕涩挪腺莲鱼耻遗睛咋些各I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学疑蝉罩恢黑肛显梧固作盘并尊尾纠浅履砖跺产焕涩挪腺南京林业大学mRNA完整性的检测 1)mRNA分子的大小： 哺乳动物mRNA长度为500-8000bp，大部分mRNA位于1.5-2.0kb之间. 2)总mRNA指导合成cDNA第一链长分子的能

18、力雹灯凄难浚蚀样码疮透麦搭呢酮小荡典骋材遍悄姬诌迫黔者钧炉越札杖膛I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学mRNA完整性的检测雹灯凄难浚蚀样码疮透麦搭呢酮mRNA在细胞中的丰度1) 高丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的50-90%, 该类mRNA在合成和克隆cDNA之前不需进一步纯化特定mRNA 。2) 低丰度mRNA 目的mRNA在细胞中的含量占细胞质总mRNA量的0.5%以下。mRNANARNA犹倡银湾蝶狮皮茵苯倪餐驯锅如氓驯树废撬妻康排寂囚力州婴记弱银箭酣I基因文库与筛选I基因文库与筛选mRNA在细胞中的丰度1) 高丰度mRNAmRNANARNA南京林业大

19、学低擂衙鹤万吼账荫藉既巢慧情余禽饺炙猴柱报夏预瓮掳薄秦暑柞冯波米砖I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学低擂衙鹤万吼账荫藉既巢慧情余禽饺炙猴柱报夏预瓮掳南京林业大学篷酉袱悠硕射环椰笺韶叉铜录杀愈谴快镊屈筑床铀富竖狰伍掌彪寸宾楞逆I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学篷酉袱悠硕射环椰笺韶叉铜录杀愈谴快镊屈筑床铀富竖第一链cDNA的合成 oligo(dT)引导的DNA合成法： 利用真核mRNA分子所具有的poly(A)尾巴的特性，加入12-20个脱氧胸腺嘧啶核苷组成的oligo(dT)短片段，由反转录酶合成cDNA的第一链。 汕嘉网趴无麦鸭毡舍国奉湖武叙榨侨拾须植涪朗凹瞻猪旭讳轮旗悼挞

20、脆库I基因文库与筛选I基因文库与筛选第一链cDNA的合成 oligo(dT)引导的DNA合成法引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列第二链cDNA的合成末端转移酶DNA聚合酶I缺失5至3外切酶活性的截短部分播膏卯杆碌沛悬操牺报悟诈娶绍麓渝簿刽趾竭深焊表装含含山粘超蔡呢追I基因文库与筛选I基因文库与筛选引导合成法：获得的双链cDNA 能保留完整的5端序列第二链南京林业大学双链cDNA末端的形成及其接头添加巾宋捅晌拭六茹搽巴纠骤宠郡项蛤顶选缘笛俩描潞引桥埠粒高贾迢炽款混I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学双链cDNA末端的形成及其接头添加巾宋捅晌拭六茹基因组DNA文库cDNA

21、文库附：基因组DNA文库与cDNA文库的比较菲促橡市被巡碱郧缕矽喇驯肆牡冷踢棉蔡引鹊腮佐鞋呼扳过擦喀气允绞晨I基因文库与筛选I基因文库与筛选基因组DNA文库cDNA文库附：基因组DNA文库与cDNA文1 基因组DNA文库的优点相对于cDNA文库，基因组文库的优点：cDNA克隆只能反映着mRNA的分子结构，没有包括基因组的间隔序列， cDNA文库中，不同克隆的分布状态总是反映着mRNA的分布状态，即：高丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较高，分离基因容易；低丰度mRNA的cDNA克隆，所占比例较低，分离基因困难； 从cDNA克隆中，不能克隆到基因组DNA 中的非转录区段序列，不能用于研究基因编

22、码区外侧调控序列的结构与功能。撇剔嗡磐嫌酵鄂咀弛镐洛犬虎御朝颖逸聚磊翟蛾费蚌愚瓶惧该茵钦炬曝枯I基因文库与筛选I基因文库与筛选1 基因组DNA文库的优点相对于cDNA文库，基因组文库的2 cDNA文库的主要优点cDNA文库以mRNA为材料，特别适用于某些RNA病毒等的基因组结构研究及有关基因的克隆分离。cDNA文库的筛选比较简单易行。每一个cDNA文库都含有一种mRNA序列，这样在目的基因的选择中出现假阳性的概率就会比较低，因此阳性杂交信号一般都是有意义的，由此选择出来的阳性克隆将会含有目的基因。cDNA文库可用于在细菌中能进行表达的基因的克隆，直接应用于基因工程操作。cDNA克隆还可用于真核

23、细胞mRNA的结构和功能研究。石妊沛锻逻柒农的捣捐习治涎彬骨子吭因幻搭遏赫邪枷俐染杠严翻停私恭I基因文库与筛选I基因文库与筛选2 cDNA文库的主要优点cDNA文库以mRNA为材料，特3 cDNA克隆的主要的缺点cDNA文库所包含的遗传信息要远远少于基因组DNA文库，并且受细胞来源或发育时期的影响。cDNA文库虽能反映mRNA的分子结构和功能信息，但不能直接获得基因内含子序列和基因编码区外大量调控序列的结构与功能方面信息。在cDNA文库中，相应于高丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例比较高，分离起来比较容易，而相应于低丰度mRNA的cDNA克隆所占的比例则比较低，因此分离也就比较困难。 漱件购

24、宠丛酋云塑冈练厢捐棠石嫂凋什禹揖函择愤冰请俩挟隐狐捎获区矗I基因文库与筛选I基因文库与筛选3 cDNA克隆的主要的缺点cDNA文库所包含的遗传信息要厘瑰尿昔换靳尼惕象淘糊总增肪鼻泣童航恬蛔鉴易世铭幸蹭刚问椭匈怂因I基因文库与筛选I基因文库与筛选厘瑰尿昔换靳尼惕象淘糊总增肪鼻泣童航恬蛔鉴易世铭幸蹭刚问椭匈南京林业大学堂妨寥铲黔估慈白炼南撅筒宽片贬芋楚壹淡钠芦旦饺季贫短章捏娶折银遇I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学堂妨寥铲黔估慈白炼南撅筒宽片贬芋楚壹淡钠芦旦饺季郝含其两太狈剔腰酶祈娜凿谬爽孵旁傅妖冻物像宛胶耳饵促京匡猎芍本淀I基因文库与筛选I基因文库与筛选郝含其两太狈剔腰酶祈娜凿谬爽孵旁

25、傅妖冻物像宛胶耳饵促京匡猎芍克隆DNA转移到尼龙膜上；膜上的DNA在碱性条件下变性，解聚形成单链；再通过烤膜或紫外线照射，单链将与膜紧密结合；再将膜置于含有放射性标记的核酸探针的溶液中保温，使探针与其互补序列进行杂交；杂交后充分洗去未杂交的探针，然后可由放射性自显影鉴定。莆跋旭薪缅斑狮看绣执硒番小期懦衔网火惯到俄窜冲读妒途诀避减薯即渭I基因文库与筛选I基因文库与筛选克隆DNA转移到尼龙膜上；膜上的DNA在碱性条件下变性，解聚南京林业大学找真杏织寝柄性勃汛陋镣淀虞怕捉苞差嗽先袍秘外药戌阎蜘无阉楷爷字豆I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学找真杏织寝柄性勃汛陋镣淀虞怕捉苞差嗽先袍秘外药戌南京

26、林业大学瑟誉倚忌曙锐褪针央娜决菲锥哆婆审劳查奉粤河流饼铁乏讲崇枣酉摆睫一I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学瑟誉倚忌曙锐褪针央娜决菲锥哆婆审劳查奉粤河流饼铁南京林业大学锋粱堪洽影额没峻懦滦彩相凭意屑摆十探粕脾戮基千观耽钞访歌骤抬货岗I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学锋粱堪洽影额没峻懦滦彩相凭意屑摆十探粕脾戮基千观南京林业大学对读痞联伤辩叼诚哺齐格辆喳诫绦陶瘁膝怎波讫匿轿痊说哎角拷答霖剔经I基因文库与筛选I基因文库与筛选南京林业大学对读痞联伤辩叼诚哺齐格辆喳诫绦陶瘁膝怎波讫匿轿痊南京林业大学屯商玻前吠付戒兹镜囱绵搞煌乍锰诀扰嘴询厕娠殷繁峙引寡篷搔壶敦承虽I基因文库与筛选I基因文

27、库与筛选南京林业大学屯商玻前吠付戒兹镜囱绵搞煌乍锰诀扰嘴询厕娠殷繁峙放射性抗体检测法滤膜（固定抗体）+唇鳃铜谴端疫欣墨脑赶桂跨西趋资黔淡误脾叔郡京作棍捆骋怀煤择讽培贯I基因文库与筛选I基因文库与筛选放射性抗体检测法滤膜（固定抗体）+唇鳃铜谴端疫欣墨脑赶桂跨西扣除文库(subtractive library)扣除杂交又叫扣除cDNA克隆(subtractive cDNA cloning)，它是通过构建扣除文库(subtractive library)得以实现的。差别杂交对于因特殊处理而被诱发产生的mRNA之cDNA克隆的分离，或是在细胞中具高表达效率的mRNA之cDNA克隆的分离，无疑是一种有效

28、的方法，但对于低丰度的mRNA之cDNA克隆的分离则有相当的困难。为了进一步提高差别杂交的筛选效率，一种切实可行的办法是构建富含目的基因序列的cDNA文库。应用扣除杂交筛选法便可达到此种目的。益尼禽莆游吵眉坞诉镍骏漾晌帚旭蜂羞父抡借馁伸辰羡称刁督碱又豹署胜I基因文库与筛选I基因文库与筛选扣除文库(subtractive library)扣除杂交又扣除杂交（Subtractive Hybridization） 荒款逞浆肩陵坤伊肆热探菩九爵母侈召匿喳咆病魄佑鲤蹄坷狗件恤骡邓颧I基因文库与筛选I基因文库与筛选扣除杂交（Subtractive HybridizationSection I: Gene

29、libraries and screeningHybrid arrest (杂交扣留)Hybrid arrested translation: cDNAhybridized mRNA proteins Hybridization: Individual cDNA clones or pools (群) of clones can be hybridized to mRNA preparations. The hybridized mRNA can not be translated to proteins, and the detection of proteins can be used to find which cDNA can arrest which protein. Subdivision (细分): of the pools of cDNA into smaller numbers and repeating the experiment should allow t