PCR核酸扩增仪-2解析课件

1、 第十三章 PCR基因扩增仪器 (polymerase chain reaction Gene Amplifier)1 第十三章1内容提要1. PCR基因扩增仪的工作原理 PCR技术的原理及发展 PCR基因扩增仪的工作原理 2. PCR扩增仪的分类与结构 定性PCR扩增仪实时荧光定量PCR扩增仪 3. PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 PCR扩增仪的性能指标PCR扩增仪的操作规程PCR扩增仪常见故障的排除 4. PCR扩增仪的应用2内容提要1. PCR基因扩增仪的工作原理 2第一节 PCR基因扩增仪工作原理 一、PCR技术的历史发展及原理 聚合酶链反应(polymerase c

2、hain reaction，PCR)是一种体外DNA扩增技术。在它发明以前，对于检测对象浓度非常低的标本，人们没有办法用常规方法测定。 1971年，Kleppe等人首次在文章中准确、客观地阐述了PCR方法。 1985年，美国PE-Cetus公司的Kary Mullis等人发明PCR技术。它推动了现代医学由细胞水平向分子水平、基因水平发展，是DNA测序的基础，它成为现代分子生物学发展过程中的一座里程碑。3第一节 PCR基因扩增仪工作原理 一、PCR技术的历史发展PCR技术是在试管中（体外）给DNA的合成提供一种合适条件-模板DNA 、dNTP、寡核苷酸引物、DNA聚合酶、合适的缓冲体系，及让DN

3、A变性、复性及延伸的温度和时间，使DNA能够体外复制。Mullis等因此项技术获得1993年诺贝尔奖。4PCR技术是在试管中（体外）给DNA的合成提供一种合适条件-PCR原理及其步骤：加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件下加入的引物同模板DNA杂交，在Taq DNA聚合酶、dNTPs、Mg2+和合适pH缓冲液存在条件下延伸引物，重复 “变性退火引物延伸”过程至25-40个循环，待测样本中的核酸拷贝数呈指数级扩大。5PCR原理及其步骤：加热使双链DNA解开螺旋，在退火温度条件其过程1：加热变性 加热（通常93左右）可将双链DNA分为两条单链，称之为“变性”。因为连接碱基之间的氢键较弱，它们在

4、高温下断裂，而脱氧核糖和磷酸之间的共价键结合力较强，在高温下保持不变。 6其过程1：加热变性 加热（通常93左右）过程2 退火，引物与靶序列结合引物是短的、人工合成的单链DNA序列，有20-30个碱基，具有标记的5端，便于下一步检测。它们对于待扩增的靶核酸是特异的。 PCR反应需有两条引物，每一条都与变性过程中产生的DNA单链互补。退火温度：通常在40-65进行，视引物的长度和碱基序列而定。这样保证了引物与靶序列退火结合的高度特异性。注意：PCR反应并不是复制整个DNA链，而是复制某一段生物体特异的100-600个碱基对的靶序列。7过程2 退火，引物与靶序列结合引物是短的、人工合成的单链D88

5、过程3：延伸一旦引物与互补DNA序列退火，温度即提高至近72，Taq DNA聚合酶被用于复制DNA链。 Taq DNA聚合酶是一种来源于嗜热水生菌（Thermus aquaticus）的重组的热稳定的DNA聚合酶，与一般聚合酶不同的是在高温状态仍具有活性。 Taq DNA聚合酶在引物标记的地方开始合成。它使溶液中自由的互补核苷酸（dNTPs）的掺入和结合，合成与目标DNA区域原始双链一样的新的双链DNA分子。 延伸通常起始于引物的3端，从而使得单链变为双链。Taq DNA聚合酶特定地从5端到3端合成。因此，溶液中的自由的核苷酸仅加于引物的3端，形成靶DNA序列的互补链。9过程3：延伸一旦引物与

6、互补DNA序列退火，温度即提高至近72101030次循环后靶序列扩增的数量-（10亿）1130次循环后靶序列扩增的数量-（10亿）11二、PCR核酸扩增仪工作原理与控温方式在PCR反应中需以变性、退火、延伸三种温度为一个循环，因此，设计PCR基因扩增仪就要能精确控制温度，这对PCR反应十分关键。Taq DNA聚合酶的应用大大提高了PCR的效率，无需在PCR反应过程中反复加入新鲜酶。Taq DNA聚合酶酶促反应最适温度为7075。最早的PCR是利用大肠杆菌DNA聚合酶I的Klenow片段进行核酸扩增。问题是该酶不耐热，当样品置于高温(9495)条件下时不可逆失活，故在退火及延伸时，需再向反应液中

7、加入新鲜酶以供扩增所需，相当繁琐。12二、PCR核酸扩增仪工作原理与控温方式在PCR反应中需以变性PCR仪温度控制，有：水浴锅控温 压缩机控温 半导体控温 离心式空气加热控温 PCR温度控制重要性：从PCR反应基本原理可知，基因扩增仪工作关键是温度控制。 13PCR仪温度控制，有：水浴锅控温 压缩机控温 半导体控温 离水浴锅控温以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。样品与水直接无缝接触，控温准确，温度均一性好，无边缘效应。体积大，自动化程度不高，需人为干预，更换水浴锅时控温不稳定。14水浴锅控温以不同温度的水浴锅串联成一个控温体系。14压缩机控温由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便，一

8、台机器便可完成整个PCR流程。但 压缩机故障率高，边缘效应及温度overshooting现象严重。overshooting：升温过程中，由于一些加热元件，比如半导体、金属块本身会积蓄能量，虽然温度探头探测温度到达了设定温度，但这些积蓄的能量仍然会传给PCR体系，造成实际的温度高于设定的温度的现象。 15压缩机控温由压缩机自动控温，金属导热，控温较水浴锅方便，一台半导体控温由半导体自动控温，金属导热，控温方便，体积小，相对稳定性好。缺点：仍有边缘效应，温度均一性尚有欠缺，各孔扩增效率可能不一致，也存在温度overshooting现象。 16半导体控温由半导体自动控温，金属导热，控温方便，体积小，

9、相对离心式空气加热控温由金属线圈加热，采用空气作为导热媒介，温度均一性好，各孔扩增效率高度一致满足荧光定量PCR的高要求，直接发展为离心式的定量PCR仪。17离心式空气加热控温由金属线圈加热，采用空气作为导热媒介，温度第二节 PCR扩增仪的分类与结构一、PCR扩增仪的种类 普通PCR扩增仪 实时荧光定量PCR扩增仪 梯度PCR仪 原位PCR仪 18第二节 PCR扩增仪的分类与结构一、PCR扩增仪的种类 一、普通定性PCR扩增仪特点 变温快、时间准、温度均一，目前国内仍有应用。仪器一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成，采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制，并经

10、计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的置放以及槽间的移动。19一、普通定性PCR扩增仪特点 变温快、时间准、温度均一，目前1水浴式PCR仪 一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成，采用半导体传感技术、电子技术和计算机技术进行水浴温度的测量、显示和控制，并经计算机控制由机械臂完成样品在每个水浴槽的置放以及槽间的移动。此类PCR仪体积较大，但变温快、时间准、温度均一，目前国内应用较少。2、变温金属块式PCR仪：中心是由铝块或不锈钢制成的热槽，上有不同数目甚至不同规格的凹孔，用来放置样品管。一般通过半导体加热和冷却，并由微机控制恒温和冷热处理过程 。装置比较牢固耐用，温度变换平稳，有利于保持Taq

11、 DNA聚合酶的活性。201水浴式PCR仪 一般由三个不同温度的水浴槽和机械臂组成3、变温气流式PCR仪 这类仪器由机壳、热源、冷空气泵、控制器及辅助元件等组成。热源由电阻元件和吹风机组成，形成热空气枪借空气作为热传播媒介，由大功率风扇及制冷设备提供外部冷空气制冷，精确的温度传感器构成不同的温度循环。该仪器不用金属精密加工，成本较低；整个系统没有液体流动及制冷剂，安全程度高。PCR仪配上微机和软件，可灵活编程。 213、变温气流式PCR仪 这类仪器由机壳、热源、冷空气泵、4梯度PCR仪 由普通PCR仪衍生出的具温度梯度功能的PCR核酸扩增仪。使用梯度PCR仪，多种变性温度和延伸温度可在一台扩增

12、仪上同时完成，既节省实验时间、提高实验效率，又节约实验成本。PCR反应能否成功，退火温度是关键，虽然有各种各样的PCR引物设计软件或者经验公式计算最合适的退火温度，可是模板中碱基的组合千变万化，经验公式得到的数据不一定都合适。梯度PCR仪每个孔的温度可以在指定范围内按照梯度设置，根据扩增结果，一步就可以摸索出最适反应条件。224梯度PCR仪 由普通PCR仪衍生出的具温度梯度功能的P5原位PCR仪 即在细胞内进行PCR扩增，而组织细胞的形态不被破坏，它是原位杂交与PCR技术的结合。以往手工方法操作复杂，扩增效果及实验结果重复性均不理想。原位PCR仪以其创新的设计，比较好地解决了这些问题。原位PC

13、R仪与普通PCR仪的区别在于，其样品基座上有若干平行的铝槽，每条铝槽内可垂直放置一张载玻片，每张载玻片面均与铝槽紧密接触，温度传导极佳，控温很精确。目前也有在普通PCR仪上增加原位PCR模块的，就可以进行原位PCR扩增。不少厂家的PCR仪都可以提供原位适配器，配有支持原位PCR模块的PCR仪可以一机两用，比较经济。235原位PCR仪 即在细胞内进行PCR扩增，而组织细胞的形（二）实时荧光定量PCR扩增仪荧光实时定量PCR技术（real-time quantitative PCR,RQ-PCR） 是在PCR反应体系中加入特异性的荧光染料或探针，荧光信号的变化真实地反映了体系中模板的增加，通过检测

14、荧光信号，从而实时监测整个PCR反应过程，最后通过标准曲线对未知模板进行定量分析。定量PCR仪通常由两部分组成，即PCR系统和荧光检测系统。目前的主流是多色多通道检测，通道及适用荧光素越多，仪器的适用范围就越宽。 24（二）实时荧光定量PCR扩增仪荧光实时定量PCR技术（reaTaqMan实时荧光定量PCR原理25TaqMan实时荧光定量PCR原理2526261、金属板式实时定量PCR仪 即传统的96孔板式定量PCR仪，由第三代的半导体PCR仪发展而来。在原有PCR仪的基础上，增加荧光激发和检测模块，升级为荧光定量PCR仪。 ABI 7500型荧光定量PCR仪的激发光源为卤钨灯，与5色滤光镜配

15、合，可同时激发96个样品；检测器为超低温CCD成像系统，可同时多点多色检测，能有效分辨FAM/SYBR GreenI、VIC/JOE、NED/TAMRA/Cy3等多种荧光染料。随机配置的定量PCR引物和探针设计软件Primer Express可以设计定量PCR所需的TaqMan探针。271、金属板式实时定量PCR仪 即传统的96孔板式定量各型号均有实时动态和终点读板(Plate Read)两种模式，实时动态模式能动态显示PCR扩增曲线的生成，定量线性范围大于9个数量级，区分5000和10000个拷贝的DNA模板可信度可达99. 7%，用于定量DNA或RNA拷贝数。终点读板模式可用于点突变检测、

16、单核苷酸多态性(SNP)分析、基因型鉴定等。增强的7900型在96孔模块的基础上可更换384孔模块，大大增强仪器高通量处理数据的能力。该类仪器还可作为普通PCR仪使用，有的甚至带梯度功能，可容纳的样本量大，无需特殊耗材。缺点 温度均一性欠佳，有边缘效应，标准曲线的反应条件难以做到与样品完全一致。28各型号均有实时动态和终点读板(Plate Read)两种模式ABI 7500荧光定量PCR仪 MJ公司Chromo 4荧光定量PCR仪 Bio-rad公司iCycler荧光定量PCR仪 29ABI 7500荧光定量PCR仪 MJ公司Chromo 4荧2、离心式实时定量PCR仪它为满足定量PCR对温度

17、的高要求而设计，克服了孔板式PCR仪固有的温度均一性较差的问题。它的扩增样品槽被设计为离心转子的模样，借助空气加热，以空气为加热介质，实现与反应体系无缝接触，加热均匀，接触面积大。转子在腔内旋转，每个孔均等位，使每个样品孔间的温度差小于0. 01，保障了标准曲线和样品之间反应条件的一致性。仪器激发光源大多采用使用寿命较长的发光二极管(light-emitting diode，LED)冷光源，运行前无需预热，无需校正。由于样品置于转子上可移动，所以仪器使用同一个激发光源和检测器，随时检测旋转到跟前的样品，有效减少系统误差，定量线性范围可达10个数量级。但这类仪器离心转子小，可容纳样品量少，有的需

18、用特殊毛细管作样品管，增加了使用成本，也不带梯度功能。302、离心式实时定量PCR仪30Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪 Light CycleTM荧光定量PCR仪 31Rotor-Gene 3000荧光定量PCR仪 Light Light CycleTM荧光定量PCR仪结构示意图 32Light CycleTM荧光定量PCR仪结构示意图 323、各孔独立控温的定量PCR仪 这种定量PCR仪设计非常独到，不同样品槽分别拥有独立的智能升降温模块，各孔独立控温，适合多指标快速检测，但目前在国内应用尚少。 仪器有16个样品槽，每个温控模块控制一个样品槽，可以在同一台定量PCR仪上分别进

19、行不同条件的定量PCR反应，随时利用空置的样品槽开始其他定量反应，使用效率非常高。 升降温速度高达10s，控温精度也高。每个模块独立控制的激发光源和检测器直接与反应管壁接触，保证荧光激发和检测不受外界干扰。333、各孔独立控温的定量PCR仪33该仪器整合成4通道光学检测系统，能有效分辨FAM/SYBR Green I、Tet/Cy3、Texas Red和Cy5等多种荧光染料，可对同一样品进行多靶点分析，同时检测四种荧光信号。可使用Taqman探针、分子信标、Amplifluor引物等多种检测方法，定量线性范围可达9个数量级。其软件允许一台仪器同时操作六个样品模块，既满足高速批量要求，又能灵活运

20、用，还可实现任意梯度反应。不足 上样不如传统方法方便，需要独特的扁平反应管，成本高。34该仪器整合成4通道光学检测系统，能有效分辨FAM/SYBR SmartCycler荧光定量PCR仪 35SmartCycler荧光定量PCR仪 35第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除 一、PCR扩增仪的性能指标 （一）温度控制 它是PCR反应能否成功的关键。包括： 1、温度的准确性：指样品孔温度与设定温度的一致性。PCR是一个指数级扩增的过程，不论是变性、退火还是延伸都需要准确控制温度，尤其是退火温度。扩增过程中退火温度的细微变化会被放大，直接影响结果。 对PCR扩增仪而言温度控制就意

21、味着质量。36第三节 PCR扩增仪的性能指标、操作规程及常见故障的排除2、温度的均一性： 是指样品孔间的温度差异，关系到不同样品孔之间反应结果的一致性。实验过程中有这样的情况：用同样的样品，同样的PCR反应程序，最后的结果差异非常明显，这就可能是因为不同样品孔的温度不均一性所致。如果PCR仪的温度均一性不佳，会影响实验结果，尤其是最外周的样品孔，即位置“边缘效应”影响结果重复性。上图为同一个标本重复测定96次的扩增曲线均一性例子372、温度的均一性： 是指样品孔间的温度差异，关系到不同样3、升降温的速度：升降温速度快，可以提高工作效率，提高PCR反应特异性，降低非特异性。所以目前PCR扩增仪的

22、温控方式已经从以前相对稳定耐用的压缩机转向了升降温速度更快的半导体。此外，制作承托样品管的基座模块材料的导热性也影响升降温速度。例如，有升降温速度高达5s的银质镀金基座，还有升降温速度可达6s和4.5s的银质模块。由于样品管与基座接触的紧密性、基座的导热性、邻近样品管的相互影响都会影响样品的实际升降温速度。所以仪器的升降温速度和样品管中样品的升降温速度并非一回事。383、升降温的速度：38目前PCR仪一般都具有模块温控模式(block-control)和反应管温控模式( tube-control)。前者，是仪器控制承载样品的金属基座温度，它由探测器直接探测基座，该模式适用于长时间的静态孵育，如

23、连接、酶切、去磷酸化等。后者，是仪器对样品管内或PCR板孔内样品液的温度来进行控制，由计算机在反应管温控模式下根据探测器所探测到的温控模块的温度计算出。后者一般更准确，因为反应管温控模式精确的算法能自动补偿时间，确保反应混合物按照程序设定的时间维持预设温度，适合各种类型的反应管。39目前PCR仪一般都具有模块温控模式(block-contro4、不同模式下的相同温度特性：主要针对梯度PCR仪而言。现在的PCR仪已可以进行不同功能模式的转换。带梯度功能的PCR仪，不仅考虑梯度模式下不同梯度管间温度的均一性和准确性，还考虑仪器在梯度模式和标准模式下是否具有同样的温度特性。否则可能导致在梯度模式下得

24、到最佳反应条件，并以此条件在标准模式下单独做，但结果却不如人意。现在已能以同样的温度变化速率到达所有设定的梯度温度，因而在梯度模式下具有恒定的温度，保证在梯度模式和标准模式下相同的温度特性。404、不同模式下的相同温度特性：405、热盖温度目前的PCR仪都带有热盖，可使样本管顶部温度达到105左右（控制温度一般为30110 ），避免蒸发的反应液凝集于管盖而改变PCR反应体积，无需再向反应管内添加石蜡油，减少了后续实验的麻烦。415、热盖温度目前的PCR仪都带有热盖，可使样本管顶部温度达到（二）荧光检测1Ct值重复性误差 在荧光定量PCR技术中，有一个很重要的概念-Ct值（cycle thres

25、hold），其含义是，每个反应管内的荧光信号到达设定的域值时所经历的循环数。模板的Ct值与它的起始拷贝数的对数存在线性关系，起始拷贝数越多，Ct值越小，因此，Ct值重复性误差对核酸定量的可靠性和正确性十分重要，一般要求CV2.5%。 2荧光检测范围 由于PCR是一个指数级扩增的过程，不同的起始拷贝数经过几十个循环后，其荧光差别十分巨大，因此，荧光检测范围一般要求达到1011010DNA (RNA) copy/ml，这是荧光仪的重要指标。 3仪器检测通道数量 复合PCR实验已成为一种流行趋势，它能节省试剂和时间，在短时间内获得结果，因此要求仪器具备多通道检测能力。目前以4通道检测的居多，部分仪器具有6个检测通道。42（二）荧光检测1Ct值重复性误差 在荧光定量PCR技术中（三）其他 1样品基座容量和样品数 多数PCR仪配备了可更换的多样化样品基座，以匹配不同规格的样品管(0.2、0.5ml PCR管；8、12联排管；96孔微孔板等)，常用0.2ml96孔。有的PCR仪，同一个样品基座有不同规