细菌内毒素检查法培训课件

1、1143细菌内 毒素检查法培训内毒素基础知识仪器试剂的简单介绍和实验原理1 1 4 3 细菌内毒素检查法-凝胶法检 查内毒素发现的历史1892年,科学家Richard在研究 霍乱弧菌的时候,发现革兰阴 性菌细胞壁外膜中有一种不溶 性成分,它能够引起人体发热、 休克、器官损害等病理表现， 因其毒性效应和性质与外毒素 有显著差异，就用内毒素这一 术语来描述该物质。随后多年 对革兰阴性菌细胞壁外膜的超 微结构技术和生物分析技术， 证实内毒素是磷脂双分子层结 构。 内毒素的组成O特异性抗原脂质A核心多糖内毒素的定义和危害内毒素（Endotoxin） 是革兰阴性菌细胞壁 外膜的脂多糖（LPS） 成分，是

2、革兰阴性菌 生长时释放或死亡后，裂解出来的其中起主要致病作用 的是非结合的游离脂 多糖（FLPS）。内毒素能够直接作用于 人体，激活组织内的炎 性细胞和炎症因子，导 致机体发热并产生全身 性炎症反应，继而引起 弥散性血管内凝血、休 克、多脏器功能衰竭等 严重的病理生理症状， 危及生命。定义危害人体内毒素的来源内源性途径外源性途径注射药品及溶液开放性创伤烧伤骨折感染休克大手术术后肝脏疾病仪器试剂的介绍及实验原理人体液检测专用鲎试剂盒湛江博康海洋生物制品有限公司生产BET-24A细菌内毒素分析仪天津大学天大天发科技有限公司生产仪器特点检测速度快稳定性更好 检测范围广标曲输入易存储空间大 灵敏度更高

3、试剂盒特点鲎试剂是唯一能够检测内毒素水平的生物试剂采用更为准确的动态浊度法进行检测鲎试剂盒由鲎试剂、I号II号检测前处理液、除菌 除热原试管和采血管、吸头及检测用水组成精心设置血液前处理流程，有效去除血细胞和蛋白的干扰，准确评估待测样本中的内毒素水平采用内毒素国家工作标准品进行质控测评，保 证检测结果准确无误采用国际通用的内毒素活性单位（EU/ml）来准 确衡量待测样本中的内毒素致病效能鲎试剂的发明1968年1月Jack Levin和 Frederik B.Bang教授在 美国马塞诸塞州Wools Hole海洋生物实验室成 功分离提取鲎血细胞并 研制成能够检测细菌内 毒素的鲎试剂，开辟了 人类

4、认识和检测内毒素 的新纪元！鲎20世纪六十年代，人 们发现一种古老的海 洋生物，被称为“海 洋活化石”的鲎，它 的血液与内毒素接触 后会发生特异性的凝 集反应，人们经过大 量研究和实验从它的 血液中提取出了用来 检测内毒素的“鲎试 剂”。内毒素的单位EU/ml 1BET-24A采用国际 通用的内毒素活性 单位EU/ml来表示 检测出的内毒素结 果；2活性单位指的是在 生物试剂在检测某 些具有某些活性的 生物时，它测得的 是这种生物说是致 病力，而不是这种 生物的重量；3不同的G菌释放的 内毒素活性不同，而 对临床最有诊断价值 的是观测到的内毒素 的致病力大小，所以 内毒素水平用活性单 位来表示

5、更客观，更 有科学意义。1EU与1个内毒素国际单位(IU)相当。实验原理 内毒素与鲎试剂的凝胶反应光密度OD时间（分钟）通过鲎试剂与内 毒素溶液混合会 发生凝集反应产 生浊度变化，通 过浓度时间反 应曲线，得出待 测样品的内毒素 浓度； 实验原理实验原理 鲎试剂与内毒素 反应是特异性的 “S”曲线，取 光密度值为0.02 点时作为反应终 点时间，内毒素 的浓度与反应时 间成反比 检测内毒素的方法定性检测凝胶法定量检测光度（浊度）法显色（比色）法动 态 浊 度 法终 点 浊 度 法动 态 显 色 法终 点 显 色 法细菌内毒素检查包括两 种方法，即凝胶法和光 度测定法 ，后者包括浊 度法和显色基

6、质法。供 试品检测时，可使用其 中任何一种方法进行试 验。当测定结果有争议 时，除另有规定外，以 凝胶限度试验结果为准。动态浊度法检测的特点动态浊度法检测的特点利用细菌内毒素在与鲎试剂形成凝 胶过程中浊度动态变化定量测定细 菌内毒素水平 动态浊度法法检测范围宽，检测范 围为 0.005EU/ml 100EU/ml，应 用范围广 对样本的内毒素含量可以定量检测，标准化程度高，适合用于临床体 液细菌内毒素引起发热及重症疾病 的早期诊断检测几种检测方法的比较凝胶法检测的特点 “限量”检测，是一种传统经典的检测方法；凝胶法是以试管内反应物凝 胶牢固程度为判断标准， 易受人为因素影响；限量检查的最低检测

7、限仅为 0.035EU/ml，因供试品稀 释倍数所限，容易被供试 品干扰，误差大。因此， 凝胶法不适合在临床用于 体液的细菌内毒素检查；显色法检测的特点显色基质法系利用鲎试剂与内 毒素反应过程中产生的凝固酶 使特定底物显色释放出的呈色 团的多少而测定内毒素含量的 方法，根据产物颜色判断内毒 素浓度。此法试剂较昂贵，操作较复杂，在一定范围之内灵敏度、 特异性较高，但检测范围窄；内毒素限值的确定药品、生物制品的细菌内毒素限值 (L )一般按以下公式确定：L = K / ML 为供试品的细菌内毒素限值 ，一般以 EU/ml、 EU/mg或 EU/U (活性单位)表示；K 为人每千克体重每小时最大可接

8、受的内毒素剂量，以EU/(kg h)表 示 ，注 射剂 K = 5EU/(kg h)， 放射性药品注射剂K = 2.5EU/(kg h)，鞘内用注射剂 K =0.2EU/(k g h);M 为人用每千克体重每小时的最大供试品剂量，以 ml/(k g h)、mg/(k g h) 或U/(k g h)表示，人均体重按 60k g计算 ，人体表面积按1.62m2计 算 。 注 射时间若不足1小时，按 1 小时计算。供试品每平方米体表面积剂量乘以 0.027即可转换为每千克体重剂量(M)按人用剂量计算限值时，如遇特殊情况，可根据生产和临床用药实际情况做必要调整，但需说明理由。确定最大有效稀释倍数（MV

9、D)最大有效稀释倍数是指在试验中供试品溶液被允许达到稀释的最大倍数， 在不超过此稀释倍数的浓度下进行内毒素限值的检测。用以下公式 来确 定MVD:MVD= cL/L 为供试品的细菌内毒素限值；C为供试品溶液的浓度，当L 以 EU/mg或 EU/U 表示 时，c 的单位需 为mg/ml或 U/m h 当 L 以EU/ml表 示时，则 c 等于 1.0ml/ml。如需计 算在MVD时的供试品浓度，即最小有效稀释浓度，可使用公式c = /L ； 为在凝胶法中鲎试剂的标示灵敏度（EU/ml)，或是在光度测定法中所使用的标准曲线上最低的内毒素浓度。列：如毒素限值是L= 0.05EU/mg =0.125E

10、U/ml那么MVD是多少？这个问题从以下几个方面考虑：1、内毒素限值L=0.05EU/mg，2、最大稀释倍数是多少，按照MVD=cL/，根据你的表述，已知L和（0.125EU/ml），需要计算MVD值需要供试品浓度，否则无法计算最大稀释倍数（MVD）的。3、按照你所表述的MVD=1时，你的供试品浓度c必须且只能是0.125/0.05=2.5mg/ml， 否则，你的MVD将不会是1。4、当按照MVD=cL/计算所得MVD=1时，也就是你的供试品原液不需要任何稀释。鲎试剂灵敏度复核试验 在本检查法规定的条件下，使鲎试剂产生凝集的内毒素的最低浓度即为 鲎试剂的标示灵敏度， 用 EU/ml表示。当使用

11、新批号的鲎试剂或试验条件 发生了任何可能影响检验结果的改变时，应进行鲎试剂灵敏度复核试验。根据鲎试剂灵敏度的标示值( )，将细菌内毒素国家标准品或细菌内毒素 工作标准品用细菌内毒素检查用水溶解， 在旋涡混合器上混匀15分钟或参 照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作，然后制成 2、 、0.5 和 0.25 四个浓度的内毒素标准溶液，每稀释一步均应在旋涡混合器上混匀 30秒或参照标准品说明书中要求的混匀时间进行操作。取不同浓度的内毒 素标准溶液，分别与等体积（如 0.1ml) 的鲎试剂溶液混合，每一个内毒素 浓度平行做4管；另外取2管加人等体积的细菌内毒素检查用水作为阴性对 照。将试管中溶液轻轻

12、混匀后，封闭管口，垂直放人37C 1 的恒温器 中，保温60分钟士2 分钟。将试管从恒温器中轻轻取出，缓缓倒转180，若管内形成凝胶，并且 凝胶不变形、不从管壁滑脱者为阳性；未形成凝胶或形成的凝胶不坚实、 变形并从管壁滑脱者为阴性。保温和拿取试管过程应避免受到振动，造成 假阴性结果。 当最大浓度2 管均为阳性，最低浓度 0.25 管均为阴性， 阴性对照管为阴性，试验方为有效。按下式计算反应终点浓度的几何平均 值，即为鲎试剂灵敏度的测定值( ） c= antilg (x/n)X为反应终点浓度的对数值(Lg)。反应终点浓度是指系列递减的内毒素浓 度中最后一个呈阳性结果的浓度；n 为每个浓度的平行管

13、数。当 c在 0.5 2 (包括 0. 5和 2 )时 ，方可用于细菌内毒素检查，并 以标示灵敏度 为该批鲎试剂的灵敏度。干扰试验 按表1制备溶液A 、B 、C 和 D，使用的供 试品溶液应为未检验出内毒素且不超过 最大有效稀释倍数 (MVD)的溶液，按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。注 ：A 为供试品溶液 ；B 为干扰试验系列 ；C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 ；D 为 阴 性 对照。只有当溶液A和阴性对照溶液D 的所有平行管都为阴性 ，并且系列溶液C 的结果符合鲎试剂 灵敏度复核试验要求时，试验方为有效。当系列溶液 B 的结果符合鲎试剂灵 敏度复核试验要 求时，认为供试品在该浓度下无干扰作

14、用。 其他情况则认为供试品在诙浓度下存在干扰作用。 若供试品 溶液在小于M V D的稀释倍数下对试验有干扰，应将供试品 溶液进行不超过M V D 的进一步稀释，再重复干扰试验。 可通过对供试品进行更大倍数的稀释或通过其他适宜的 方法（如过滤、中和、透析或加热处 理等）排除干扰。为确保所选择的处理方法能有效地排除干扰且不会使内毒素失去活性，要使 用预先添加了标准内毒素再经过处理的供试品溶液进行干扰试验。 当进行新药的内毒素检查试验前，或无内毒素检查项的 品种建立内毒素检査法时，须进行 干扰试验。当鲎试剂、供试品的处方、生产工艺改变或试验环境中发 生了任何有可能影响试验结果的 变化时，须重新进行干

15、扰试验(1) 凝胶限度试验按表2制备溶液 A 、B 、C 和 D。使用稀释倍数不超过 M VD并且已经排除干扰的供试品溶液来制备溶液A 和 B。 按鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。注：A为供试品溶液；B为供试品阳性对照；C为阴性对照；D为阳性对照；结果判断 保温60后观察结果。若阴性对照溶液分钟2 分钟D的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B的平行管均为阳性，阳性对照溶液C的平行管均为阳性，试验有效。 若溶液A的两个平行管均为阴性，判定供试品符合规定。若溶液个平行管均为阳性，判定供试A 的两品不符合规定。若溶液A的两个平行管中的一管为阳性，另一管为阴性，需进行复试。复试时溶液A需做4支平行管，若

16、所有平行管均为阴性，判定供试品符合规定，否则判定供试品不符合规定。若供试品的稀释倍数小于MVD而溶液A结果出现不符合规定时，可将供试品稀释至MVD重新实验，再对结果进行判断。 (1) 凝胶半定量试验 本方法系通过确定反应终点浓度来量化供试品中内毒素 的含量。按表 3 制备溶液 A 、B 、C 和 D。按 鲎试剂灵敏度复核试验项下操作。 注 ：A 为不超过MVD并且通过干扰试验的供试品溶液 。从通过干扰试验的稀释倍数开 始 用检查用水稀释如1倍 、2倍 、4倍和8倍，最后的稀释倍数不得超过MVD。B为含2浓度标准内毒素的溶液 A（供试品阳性对照 ）C 为鲎试剂标示灵敏度的对照系列 D 为阴性对照 。 结果判断若阴性对照溶液 D 的平行管均为阴性，供试品阳性对照溶液B 的平行管均为阳性，系列溶液 C 的反应终点浓度的几何平均值在0.5 2，试验有效。系列溶液A 中每一系列平行管的终点稀释倍数乘以， 为每个系列的反应终点浓 度。如果检验的是经稀释的供试 品，则将终点浓度乘以供试品进行