ch17 基因工程课件

1、Genetic recombination and genetic engineering基因重组和基因工程1. 自然界的基因转移和重组 接合作用（conjugation） 转化作用（transformation） 转导作用（transduction） 转座（transposition） 基因重组（gene recombination）接合作用（conjugation） 当细菌与细菌通过菌毛相互接触时，质粒DNA从一个细菌转移到另一个细菌，这种DNA转移称为接合作用。 质粒：细菌染色体外的小型环状双链DNA分子。F+细胞F细胞F factor and conjugation Avery the

2、 discovery of DNA as genetic material（无荚膜,R）（弱毒性）S (heat-killed) Mouse livesR+S(heat-killed) Mouse dies 转导作用（transduction） 通过噬菌体将基因从一个细菌转移到另一个细菌的过程。Transduction转座（transposition） 基因组中可移动的DNA序列包括插入序列（insertion sequences, IS）和转座子（transposons）。 由插入序列或转座子介导的基因转移或基因重排称为转座。基因重组（gene recombination） 在接合、转化、转

3、导或转座过程中，不同DNA分子间发生的共价连接作用。 可分为： 同源重组（homologous recombination）： 发生在同源序列间的重组称为同源重组，又 称基本重组。 位点特异性重组（sitespecific recombination）： 由整合酶催化、在两个DNA序列的特异位点间发生的整合。 2. 重组DNA 技术 Recombinant DNA technology 2.1 重组DNA技术相关概念2.1.1 DNA克隆（DNA cloning） 克隆（clone）：来源于同一始祖的相同副本或拷贝的集合。 克隆化（cloning）：获取同一拷贝集合的过程，即无性繁殖。 从不同

4、水平有：分子克隆，即DNA 克隆 细胞克隆 个体克隆（动物或植物） 基因克隆过程示意图 基因工程实现基因克隆所采用的方法及相关的工作统称为基因工程（genetic engineering），又称重组DNA技术（recombinant DNA technology）。 基因工程、蛋白质工程、酶工程、细胞工程、生物医学工程、生物信息工程成为现代生物技术工程的主要支柱。限制性核酸内切酶（restriction endonuclease, RE） 定义：识别DNA的特异序列，并在识别位点或其周围切割双链DNA的一类内切酶。 作用：与甲基化酶共同构成细菌的限制修饰系统，限制外源DNA，保护自身DNA。

5、分类：、（重组DNA技术常用）、识别和酶切是同一序列；识别序列一般46bp,具有回文结构；切口可为粘端或平端。双酶切克隆2.2 重组DNA技术的基本原理目的基因的获取克隆载体的选择和构建目的基因与载体的连接重组DNA导入受体细胞重组体的筛选克隆基因的表达目的基因的获取 化学合成法 基因组文库筛选法 cDNA文库筛选法 聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR） 化学合成法要求：已知目的基因的核苷酸序列或其产物的氨基酸序列。基因组文库（genomic library）genomic librarycDNA文库（cDNA library） 存在于转化细胞内由克

6、隆载体所携带的所有由mRNA逆转录而来的cDNA的集合。 Reverse transcription聚合酶链式反应 （polymerase chain reaction, PCR） by Kary Mullis in 1983. simple, specific and potent. template DNA, primers, TaqE, dNTP etc.denatureannealingextensionPCR反应原理PCR引入酶切位点基因载体 基因载体：为携带目的基因，实现其无性繁殖或表达有意义的蛋白质所采用的DNA分子。载体的选择条件： 能自主复制。 具有两个以上的遗传标记，便于重

7、组体的筛选和鉴定。 有多克隆位点，即多个单一酶切位点。 分子量小，以容纳较大的外源DNA。 常用载体：质粒（plasmid）噬菌体（bacteriophage）科斯质粒（cosmid vector）细菌人工染色体（bacterial artifitial chromosome）酵母人工染色体（yeast artifitial chromosome）病毒改造载体（植物病毒、动物病毒）质粒（Plasmid） 质粒是存在于细菌染色体之外、能独立自主复制的小型环状双链DNA分子。常带有某些遗传信息，赋予宿主细胞一些遗传特性，如抗生素抗性、重金属抗性等。 pBR322 4363bp Polylinker

8、 MCS: multiple cloning sitePromegapolylinker-an insert with multiple restriction sites or multiple cloning sites(MCSs)噬菌体（ Bacteriophage） 噬菌体是侵染细菌的病毒。利用噬菌体侵染细菌的生活特性将噬菌体改装为载体。Bacteriophage cloning vector 一般分为： 克隆载体（cloning vector）：目的是使插入的外源DNA序列扩增的载体。 克隆载体带有一些利于扩增的元件，如松弛型的复制起点等等。 表达载体（expression vect

9、or）：目的是使插入的外源DNA序列转录翻译为多肽链的载体。 表达载体常带有一些利于表达或纯化的元件，如强启动子、翻译调控序列、报告基因、融合基因等等。分为原核表达载体和真核表达载体。原核表达载体主要组成元件示意图Invitrogen真核表达载体示例常用方法有： 抗药性标记选择，如插入失活法； 标志互补，如互补； 分子杂交法，如原位杂交、Southern印迹重组体的筛选插入失活法筛选示意图互补筛选示意图原位杂交Southern印迹克隆基因的表达表达体系的建立： 表达载体的构建 受体细胞的选择 表达产物的分离纯化原核表达体系以E.coli为代表优点：培养简单、迅速、经济，适合大规模生产工艺，遗传背景清楚。缺点：不能表达真核基因组DNA；不能加工真核蛋白质；表达的蛋白质常形成不溶性包涵体，难获得大量可溶性蛋白。真核表达体系常用酵母、昆虫、哺乳动物细胞。优点：能表达真核基因组DNA和cDNA；能适当修饰表达的蛋白质；表达产物分