分子杂交演示文稿

1、分子杂交演示文稿第一页，共二十九页。（优选）第六讲分子杂交第二页，共二十九页。 分子杂交实质上是DNA或RNA单链之间退火形成DNA/RNA或DNA/DNA杂合分子。 应用范围： 重组子鉴别 基因分离 DNA片段分析 基因表达研究 。 第三页，共二十九页。 当用一个标记核酸分子与核酸样品杂交，便可以查明该样品中是否存在与该标记核酸分子具有同源性的分子。第四页，共二十九页。2 探针的概念及其标记技术2.1 探针(probe): 用于检测特定基因或转录产物存在或表达的DNA、RNA或寡核苷酸。 第五页，共二十九页。 2.2 探针的标记技术 2.2.1 均匀标记 2.2.2 末端标记第六页，共二十九

2、页。2.2.1 均匀标记 切口平移法标记 DNaseI HO P5 35 35 3DNaseI与Pol I 的切口移位Pol I第七页，共二十九页。 随机引物标记 PCR扩增标记 要求： a-32PdNTP 第八页，共二十九页。5353555555333333热变性随机引物退火 -32PdNTP Klenow 酶 555 5 第九页，共二十九页。2.2.2 末端标记 DNA片段的末端标记 Klenow酶 3-末端补平(3-末端标记) 5-ACGTTGCAAACTG-3 3-TGCAACGTTTGAC-5第十页，共二十九页。四种不同的补平反应5-GGATCC-3 BamHI 5-G GATCC-

3、33-CCTAGG-5 3-CCTAG G-5 dNTP dGTP dGTP/dATP dGTP/dATP/dTTP5-GGATC 5-GG 5-GGA 5-GGAT 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG 3-CCTAG GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 GATCC-3 CTAGG-5 GG-5 AGG-5 TAGG-5 I S1 S1 S1 5-GG CC-3 5-GGA TCC-3 5-GGAT ATCC-3 3-CC GG-5 3-CCT AGG-5 3-CCTA TAGG-5 II III 第十一页，共二十九页。 T4 DNA polymerase T7 DNA

4、 polymerase T4 多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase) 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)第十二页，共二十九页。 合成寡核苷酸的标记 T4 多核苷酸激酶(T4 polynucleotide kinase) 末端脱氧核苷酸转移酶(TdT) 第十三页，共二十九页。3 分子杂交技术根据检测对象的不同： Southern 杂交 Northern杂交 Western杂交 斑点杂交 狭线杂交 菌落杂交第十四页，共二十九页。 1975年,Southern印迹杂交（Southern blot）由英国人埃德温迈勒萨瑟恩 （Edwin Mellor Southern）创建。 3

5、.1 Southern 杂交埃德温迈勒萨瑟恩 第十五页，共二十九页。Southern 杂交操作步骤： 印迹转移(blotting) 将DNA片段从琼脂糖凝胶转移到滤膜的方式。第十六页，共二十九页。带有DNA片段的凝胶DNA分子酶切片段 限制性酶切琼脂糖电泳 通过毛细管渗吸或电转移或真空转移方式80或紫外线处理将DNA固定在滤膜上杂交、显影凝胶滤膜0.4MNaOH溶液中DNA变性在1.5MNacl+1MTris中和，保存单链状态。吸附有ssDNA的膜Southern 印迹杂交的技术流程第十七页，共二十九页。 印迹转移方式(1) 毛细管渗吸法第十八页，共二十九页。白瓷盘玻璃板滤纸凝胶尼龙膜滤纸吸水

6、纸玻璃板重物毛细管渗吸法第十九页，共二十九页。真空转膜槽滤纸尼龙膜凝胶盖子印迹转移方式(2)真空转膜第二十页，共二十九页。第二十一页，共二十九页。印迹转移方式(3)电转移第二十二页，共二十九页。 分子杂交 预杂交 目的：将滤膜的空白处用鱼精DNA或牛奶蛋白封闭起来，防止在杂交过程中滤膜本身对探针的吸附 。 预杂交液实际上就是不含探针的杂交液，其中主要含有鱼精DNA、牛血清等，这些大分子可以封闭膜上所有非特异性吸附位点。 第二十三页，共二十九页。 杂交 在一定的溶液和温度下，将标记的探针与滤膜混合； 洗涤 25 1SSC/0.1%SDS 杂交温度 0.25SSC/0.1%SDS 放射性自显影或生

7、化检测。 第二十四页，共二十九页。Southern杂交Edward Southern（1）提取总DNA（2）酶解（3）电泳（4）转移到滤膜（5）变性解链（6）DNA探针及杂交（7）洗脱（8）放射自显影（9）比较分析第二十五页，共二十九页。Southern杂交的主要应用： 判断某一生物样品中是否存在某一基因，以及该基因所在的限制性酶切片段的大小。第二十六页，共二十九页。3.2 Northern杂交 印迹转移的是总RNA或mRNA。 应用：在转录水平上某基因是否表达，在有合适对照的情况下，通过杂交信号的强弱可比较基因表达的强弱。第二十七页，共二十九页。3.3 Western杂交 印迹转移的是蛋白质。 将待检测蛋白质（或酶）经PAGE电泳并染色后，转移到滤膜上固定，再用“抗体-抗原”免疫反应鉴别滤膜上的蛋白质。 探针:针对某一蛋白质制备