发酵工程灭菌和空气除菌

1、关于发酵工程的灭菌与空气除菌第1页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四1) 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力；2) 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主；3) 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难；4) 杂菌会降解目的产物；杂菌会污染最终产品；5) 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象。在发酵过程中染菌严重的后果第2页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四第一节 常用的灭菌方法一、定义 1、培养基灭菌的定义 从培养基中杀灭所有有生活能力的微生物营养体及其孢子，或从中将其除去。 工业规模的液体培养基灭菌，

2、杀灭杂菌比除去杂菌更为常用。第3页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四第一节 常用的灭菌方法2、灭菌与消毒的区别灭菌（sterilization）：用物理或化学方法杀死或除去环境中所有微生物，包括营养细胞、细菌芽孢和孢子。消毒：用物理或化学方法杀死物料、容器、器皿内外的病源微生物。 第4页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四二、工业生产中的灭菌1、工业上具体措施包括:（1）使用的培养基和设备须经灭菌；（2）好氧培养中使用的空气应经除菌处理；（3）设备应严密，发酵罐维持正压环境；（4）培养过程中加入的物料应经过灭菌；（5）使用无污染的纯粹种子。第5页，共50页，2

3、022年，5月20日，7点9分，星期四二、工业生产中的灭菌2、培养基灭菌的目的 杀灭培养基中的微生物，为后续发酵过程创造无菌的条件。3、培养基灭菌的要求（1）达到要求的无菌程度(10-3)。（2）尽量减少营养成分的破坏，在灭菌过程中，培养基组分的破坏，是由两个基本类型的反应引起的：培养基中不同营养成分间的相互作用；对热不稳定的组分如氨基酸和维生素等的分解。第6页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四4、灭菌的方法（1）化学法（化学药品灭菌法）： 化学药品直接作用于微生物而将其杀死的方法。消毒剂与防腐剂的区分并不严格。 灭菌机理： 化学物质（高锰酸钾、漂白粉等）与微生物细胞中的某些

4、成分产生化学反应，如蛋白质变性、核酸的破坏、酶的失活、细胞膜透性的改变而杀死微生物。 第7页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四8常用的化学药剂： 石碳酸、甲醛、氯化汞、碘酒、酒精等。主要用于生产车间环境、无菌室空间、接种操作前小型器具及双手的消毒等以及染菌后的培养基。 根据灭菌对象的不同使用方法有浸泡、添加、擦拭、喷洒、气态熏蒸等。第8页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（2）物理法 射线灭菌法： 利用紫外线、高能电磁波或放射性物质产生的射线进行灭菌的方法。波长范围在200275nm的紫外线具有杀菌作用，杀菌作用最强的范围是250 270nm，波长为253.

5、7nm的紫外线杀菌作用最强。 在紫外灯下直接暴露，一般繁殖型微生物约3 5min，芽孢约10min即可杀灭。第9页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四10紫外线灭菌机理： 在紫外线照射下微生物细胞的DNA遭到破坏，形成胸腺嘧啶二聚体和胞嘧啶水合物，抑制DNA的复制。此外，空气在紫外线照射下生成的臭氧也有一定的杀菌作用。紫外线穿透力较差，一般只适于接种室、超净工作台、无菌培养室及物质表面杀菌。不同微生物对紫外线的抵抗力不同，对杆菌杀灭力强，对球菌次之，对酵母菌、霉菌等较弱，因此常与化学灭菌结合使用。第10页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（2）物理法 干热灭菌

6、法 ： 灭菌机理：在干燥高温条件下，微生物细胞内的各种与温度有关的氧化还原反应速度迅速增加，致死微生物。 灼烧灭菌法；玻璃器皿、金属器材和其他耐高温的物品在干热灭菌器中，于160下保存1h。有纸或棉塞者灭菌不能超过170。第11页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（2）物理法 过滤除菌： 使用适当的过滤材料或介质对液体或气体进行过滤，除去微生物的方法。 主要适用于：热敏感物质（生长因子、抗生素、培养基）的灭菌和发酵用无菌空气的制备。第12页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四湿热灭菌法： 利用饱和蒸汽进行灭菌。释放大量热量和强大穿透力使生物大分子化学键受到破坏

7、。常用于培养基、发酵设备、附属设备、管道和实验器材的灭菌。煮沸灭菌法：将物品在水中煮沸15-20min，一般微生物细胞可杀死，但不能杀死孢子。适用于食品、器具消毒。无芽孢菌用60 10min，芽孢用100 10min以上，嗜热细菌用120 20-30min可完全杀死。 第13页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四间歇灭菌法： 反复几次的常压蒸汽灭菌，已达到杀死微生物营养体和芽孢的目的。100 30-60min而杀死微生物营养体，置37 培养1h，使其芽孢发育成营养体，次日再同样的方法处理，反复3次。适用于不能高压灭菌的物质，如糖类、明胶、牛奶培养基等。高压蒸汽灭菌： 使用密闭的

8、高压蒸汽灭菌锅。实验室常用压力为0.1兆帕（MPa，一公斤的压力），121 15-30min，可杀死各种微生物及芽孢。常用于培养基、发酵设备、管道、实验器材等。 第14页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四第二节 培养基与发酵设备的灭菌一、影响培养基灭菌的因素（1）培养基成分 培养液中油脂、糖类及一定浓度的蛋白质会增加微生物的耐热性。高浓度盐类、色素能削减其耐热性。 随着灭菌条件的强化, 培养基成分的热变质加速，特别是维生素。因此培养液灭菌一般都采用高温短时加热的方式，这样可以达到彻底灭菌和把营养分破坏减少到最低限度的目的。第15页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，

9、星期四一、影响培养基灭菌的因素（2）培养基成分颗粒度 培养基成分的颗粒越大，蒸汽穿透所需时间越长。小于1mm颗粒的培养基，可不必考虑颗粒对灭菌的影响，但对于含有少量大颗粒及粗纤维培养基的灭菌，特别是存在凝结成团的胶体时会影响灭菌效果，则应适当提高灭菌温度或过滤除去。第16页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（3）培养基pH pH对微生物耐热性影响很大。微生物一般在pH6.08.0时最耐热；pH6.0，氢离子易渗入微生物细胞内，从而改变细胞的生理反应促使其死亡。pH越低，灭菌所需时间越短。（4）微生物细胞含水量 含水量少，蛋白质不易变性，但在灭菌时，如果是含水量很高的物品，高温

10、蒸汽的穿透效果也会降低，所以灭菌时间也要延长。第17页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（5）微生物性质与数量 1) 各种微生物对热的抵抗力相差较大，细菌的营养体、酵母、霉菌的菌丝体对热较为敏感，而放线菌、酵母、霉菌孢子对热的抵抗力较强； 2) 繁殖期的微生物对高温的抵抗力比衰老期微生物抵抗力 小得多； 3) 微生物数量越多，所需灭菌时间越长； 4) 天然原料配成的培养基含菌量高于纯粹用化学试剂配制成的组合培养基。第18页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（6）冷空气排除情况 冷空气不但导热性差，阻碍蒸汽接触欲灭菌的物品，还会降低蒸汽分压，使罐内实际温度低于

11、压力表所对应的温度，造成灭菌温度不够。（7）泡沫 泡沫中的空气形成隔热层，使热量难以渗透进去，需加消泡剂。（8）搅拌 避免局部过热或形成灭菌死角。第19页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四二、培养基的灭菌 无菌的标准： 根据微生物热死灭方程，要求灭菌后达到绝对无菌是很难做到的，也是不必要的。因此在工程设计中常取N=10-3(N:培养基中残存的活菌数）。 工业化生产中培养基的灭菌采用湿热灭菌方式，主要有两种方法：分批灭菌和连续灭菌。第20页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（一）分批灭菌（batch sterilization）又称间歇灭菌，就是将配制好的培养

12、基全部输入发酵罐内或其他装置中，通入蒸汽将培养基和所用设备加热至灭菌温度后维持一定时间，再冷却到接种温度，这一工艺过程称为实罐灭菌，是使培养基和发酵罐同时灭菌的一种方式。优点：无需专一灭菌设备，操作简便。缺点：加热和冷却时间较长，易发生过热破坏营养分 的现象，发酵罐利用率低。灭菌流程：包括：加热、维持、冷却3阶段。第21页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四流程操作： 先预热一定时间，使物料溶胀均匀受热，预热90以上时，将蒸汽直接通入培养基及罐中，可减少冷凝水生成量。温度达到120时计算维持时间。生产中常用维持时间30min。为了减少营养成分的破坏多采用快速冷却方式，立即向罐内

13、通入无菌空气，以维持罐压,然后开启冷却系统进行冷却。第22页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四分批灭菌设备示意图三路进汽：蒸汽从通风、取样和出料口进入罐内直接加热，直到所规定的温度，并维持一定的时间。这就是所谓的“三路进气”。四路出汽：在液面以上的管道口则应排放空气，即蒸汽从排气、接种、进料和消沫剂管排气。这样做可以达到不留灭菌死角。第23页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（二）连续灭菌(continuous sterilization)连续灭菌是将培养基通过专门设计的灭菌器，进行连续流动灭菌后，进入预先灭过菌的发酵罐中的灭菌方式，也称之为连消。连续灭菌设

14、备主要由灭菌系统、冷却系统、烘干系统及电器系统组成。附属设备由进料输送带散布机，出料输送带等组成。灭菌系统采用专一灭菌设备-连消塔(或器)。优点：高温快速灭菌工艺，营养成分破坏的少；发酵罐的非生产占用时间短，容积利用率提高；热能利用合理，适合实行自动化控制；缺点：不适用于粘度大或固形物含量高的培养基灭菌； 增加一套连续灭菌设备，增多了操作环节，增加染菌 的机率。第24页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四连消塔-喷淋冷却连续灭菌的基本流程流程：在短时间内使物料在连消塔中的温度达到灭菌温度126132，然后进入维持罐中保温5 8min，然后物料以层流的方式保持先进先出、后进后出的

15、状态流至维持罐出口完成灭菌时间，再进入冷却器快速换热冷却后进入灭菌完毕的发酵罐中。第25页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四喷射加热-真空冷却连续灭菌流程图典型的蒸汽喷射式-真空冷却过程中培养基温度随时间的变化曲线喷射器结构示意图第26页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四连续灭菌与分批灭菌的比较1、连续灭菌的优缺点 优点 保留较多的营养质量； 容易放大； 较易自动控制； 糖受蒸汽的影响较少； 缩短灭菌周期； 在某些情况下，可使发酵罐的腐蚀减少； 发酵罐利用率高； 蒸汽负荷均匀。 缺点 设备比较复杂，投资较大。2、分批灭菌的优缺点 优点 设备投资较少； 染菌的

16、危险性较小； 人工操作较方便； 对培养基中固体物质含量较多时更为适宜； 缺点 灭菌过程中蒸汽用量变化大，造成锅炉负荷波动大，一般只限于中小型发酵装置。第27页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（三）固体培养基灭菌固体培养基要先蒸煮灭菌,但固体培养基呈粒状、片状或粉状，流动性差，不易翻动，吸水加热易成团, 冷却困难。针对这些特点设计的转鼓式灭菌机常用于酒厂、酱油厂。转鼓式灭菌器，可以0.51r/min转动，培养基能得到较为充分的混匀，轴的中心是一带孔的圆管，蒸汽沿轴中心通入鼓内培养基中进行加热，达到一定温度后，进行保温灭菌。灭菌结束后用真空泵对转鼓抽气，降低鼓内压力和培养基的温

17、度。1、吸气口；2、真空管；3、花管；4、搅拌叶；5、水蒸气转鼓式灭菌器第28页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四三、管道与发酵罐等的灭菌（1）种子罐、发酵罐、计量罐、补料罐等的空罐灭菌及管 道灭菌 从有关管道通入蒸汽，使罐内蒸汽压力达0.147 MPa，维持45 min，灭菌过程从阀门、边阀排出空气，并使蒸汽通过到达死角灭菌。（2）空气总过滤器和分过滤器灭菌 排出过滤器中的空气，从过滤器上部通入蒸汽，并从上、下排气口排气，维持压力0.174 MPa灭菌2 h。灭菌完毕，通入压缩空气吹干。（3）补料实罐灭菌 根据料液不同而异，淀粉料液为121 ，维持5 min；尿素溶液灭菌1

18、05 ，维持5 min。 第29页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四第三节 空气的除菌一、发酵使用的净化空气的标准二、空气净化的方法三、介质过滤除菌的原理四、空气净化的工艺流程第30页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四一、发酵使用的净化空气的标准（一）无菌空气的概念 发酵工业应用的“无菌空气”是指通过除菌处理使空气中含菌量降低在一个极低的百分数，从而能控制发酵污染至极小机会。此种空气称为“无菌空气”。第31页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四一、发酵使用的净化空气的标准（二）空气中微生物的分布 空气中的含菌量随环境不同而有很大差异： 一般干

19、燥寒冷的北方空气中的含菌量较少， 而潮湿温暖的南方则含菌量较多； 人口稠密的城市比人口少的农村含菌量多； 地面又比高空的空气含菌量多。 各地空气中所悬浮的微生物种类及比例各不相同，数量也随条件的变化而异，一般设计时以含量为103104个m3进行计算。第32页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（三）发酵对空气无菌程度的要求 各种不同的发酵过程，对空气无菌程度的要求也不同：不同菌种的生产能力、生长速度、发酵周期、产物性质、培养基营养成分和pH的差异等不同，对空气质量有不同的要求；如：氨基酸和抗生素因发酵周期长短的不同；对无菌空气 要求不同。 发酵工业的“无菌空气”；一般按染菌机率

20、为10-3来计算，即1000次发酵周期所用的无菌空气只允许12次染菌。第33页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四同一工厂的不同生产区域有不同的空气质量要求。 空气无菌程度用空气洁净度来表示，指洁净环境中空气含尘（微粒）量多少的程度。 空气洁净度的具体高低用空气洁净度级别来区分，这种级别又是用操作时间内空气的计数含尘量（就是单位容积空气中所含某种大小微粒的数量）来表示的。环境空气的洁净等级生产区分类洁净级别/级每升空气中0.5mm尘粒数每升空气中5mm尘粒数菌落数/个控制区100 0003500251010 0003502.53洁净区1000350.2521003.501第34

21、页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四二、空气净化的方法空气净化就是除去或杀灭空气中的微生物。主要有： 热杀菌（加热灭菌） 辐射杀菌 静电除菌 过滤除菌第35页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（一）热杀菌利用压缩热进行空气灭菌的流程图空气进口温度为21，出口温度为187198，压力为0.7MPa；空气经压缩后温度升高达到干热灭菌目的.第36页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（二）辐射杀菌1、原理 射线、X射线、射线、射线、紫外线、超声波等从理论上讲都能破坏蛋白质，破坏生物活性物质，从而起到杀菌作用。2、应用范围 通常用于无菌室和医院手术室

22、。3、缺点 杀菌效率较低，杀菌时间较长。一般要结合甲醛蒸汽等来保证无菌室的无菌程度。不适宜大规模的空气灭菌。第37页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（三）静电除菌1、原理 利用静电引力来吸附带电粒子而达到除尘、除菌的目的。悬浮于空气中的微生物，其孢子大多带有不同的电荷，没有带电荷的微粒进入高压静电场时都会被电离变成带电微粒。2、优点 阻力小，约1.01325104Pa 染菌率低，平均低于10-15 除水、除油的效果好 耗电少。 管式静电除尘器1-钢丝（电晕电极）；2-钢管（沉淀电极）；3-高压绝缘瓷瓶；4-钢板；5-空气出口；6-封头；7-钢板；8-法兰；9-空气进口。3、

23、缺点 设备庞大、一次性投资较大、捕集率尚嫌不够，需要采取其它措施。第38页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（四）介质过滤除菌（1）定义：让含菌空气通过过滤介质以阻截空气中所含微生物，而取得无菌空气的方法。通过过滤处理的空气可达无菌，并有足够的压力和适宜的温度以供耗氧培养过程使用。该法是目前广泛用来获得大量无菌空气的常规方法。第39页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（2）空气过滤器一个空气过滤器的功能是从气体中除去污染物（微生物）以使达到所需的气体的无菌程度。过滤器经常被认为是一种简单的网或筛子，过滤/分离是在一个平面上进行的。实际上，空气过滤器的滤材具有

24、深度。“弯曲通道” 的结果对污染物的去除起到了辅助作用。第40页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（3）绝对过滤和深层过滤绝对过滤： 过滤介质孔隙小于或大大小于被过滤的微粒直径，其孔隙小于0.5mm，甚至小于0.1mm（一般大小为1mm），将空气中的细菌除去。深层过滤： 污染物被过滤介质内部捕获的一种过滤方式，滤孔贯穿于整个介质厚度。绝对过滤深层过滤第41页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四42深层过滤又分为两种 以纤维（以棉花、玻璃纤维、尼龙等）或颗粒状（活性炭）介质为过滤层，这种过滤层较深，其空隙一般大于50mm，即远大于细菌，因此这种除菌不是真正意义上

25、的过滤作用，而是靠静电、扩散、惯性和阻截等作用将细菌截留在滤层中； 用超细玻璃纤维（纸）、石棉板、烧结金属板、聚乙烯醇、聚四氟乙烯等为介质，滤层薄，但孔隙仍大于0.5mm，因此仍属于深层过滤的范畴。第42页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四三、空气净化的工艺流程发酵使用的无菌空气除对无菌程度有要求外，还要充分考虑空气的温度、湿度与压力。无菌空气制备的整个过程包括两个部分： 一是对进入空气过滤器的空气进行预处理，达到合适的空气状态（温度、湿度）； 二是对空气进行过滤处理，以除去微生物颗粒，满足生物细胞培养需要。第43页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四三、空气

26、净化的工艺流程空气净化一般过程：吸气口吸入的空气压缩前的过滤空气压缩机(120-150 ）冷却到适当的温度（ 2025 ）除去油和水。加热至3035，使其相对湿度为50% 60%。总过滤器和分过滤器除菌洁净度、压力、温度和流量都符合要求的无菌空气。空气预处理第44页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四空气除菌设备流程空气预处理第45页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四1、采风塔 提高空气吸气口的高度可以减少吸入空气的微生物含量。2、粗过滤器 吸入的空气在进入压缩机前先通过粗过滤器过滤，可以减少进入空气压缩机的灰尘和微生物，减少往复式空气压缩机活塞和气缸的磨损，减轻介质过滤除菌的负荷。3、空气压缩机 为克服输送过程中过滤介质的阻力，吸入的空气必须经空压机压缩，由于压缩过程可看做是绝热过程，因此压缩后的空气温度显著上升。空气预处理第46页，共50页，2022年，5月20日，7点9分，星期四（1）一级空气冷却器 用30左右的水，把从压缩机出来的120 或150 的空气冷却到 4050左右。（2）二级空气冷却器 用9 冷冻水或151