中草药鉴定种特异性DNA探针的筛选方法

1、中草药断定种特异性DNA探针的挑选要领【摘要】基因芯片技能为中草药高效、并行、快速断定提供了大概。而中草药种特异性探针的挑选是中草药基因芯片断定技能开拓的关剑文章结合当今中药区分芯片和别的物种断定芯片研究希望总结了几种得当中草药特异性探针挑选的要领。【关键词】基因芯片；中草药区分；种特异；DNA探针Abstrat:DNAhiptehnlgyakesitfeasibletidentifyhineseherbalediinerapidly,effiientlyandinparallel.Thesreeningfspeies-speifiDNAprbesfrediinalplantsisthekey

2、stepindevelpingDNAhipfrtheauthentiatinfhineseherbalediines.binedithurrentDNAhipresearhesnidentifiatinfherbalplantsrtherspeies,seethdsavailablefrthesreeningfediinalplantsspeies-speifiDNAprbeseresuarizedinthispaper.Keyrds：DNAhip;Herbalediine;Speies-speifiDNAPrbe在中药材基因区分和特性性基因测序的底子上，创立以基因诊断和基因芯片为载体的中药材

3、分子区分技能和要领是以后中药生物技能研究中的积极标的目的之一1。中药断定的基因芯片技能是指接纳原位合成或显微打印本领，将中药种特异性DNA探针结实在玻璃片、尼龙膜或别的支持物外貌上，形成二维DNA探针阵列，然后与荧光或DIG标识表记标帜待检中药基因组DNA样本杂交，通过检测杂交信号来实现对中药的正确、并行、高效地检测。固然DNA芯片技能已普及应用于DNA测序2、单核苷酸多态性阐发3、基因表达阐发4、基因诊断5、药物挑选6、微生物种类断定等7各个方面，但应用于中药断定尚处于起步阶段，比年来随着基因芯片技能的普及应用，国表里一些研究机构已开始研究利用基因芯片对中药(材)举行区分8，9。接纳基因芯片

4、技能断定中药的根本历程是10：应用分子生物学技能寻出待断定中药的特定寡核苷酸序列；以此寡核苷酸序列作为探针，装配到芯片上；检测样品DNA的提娶扩增和标识表记标帜；杂交检测及结果阐发。此中寻出待定中药的特定DNA序列DNA探针是创立中草药断定基因芯片的关键。本文结合比年来中药及别的物种区分芯片研究希望总结了几种可用于中草药特异性DNA片断挑选的要领，并对这些要领的上风和不敷做出评价。1利用现有药用植物基因资源挑选其特异性片断这种要领简朴、快捷，充实利用了现有的基因资源。如今许多微生物检测探针11,12及植物DNA探针13都是按照已公然的基因序列方案的。然而，对付大多数药用植物种类，其遗传配景很不

5、明晰。已注册的药用植物DNA序列的数目相对付总的药用植物资源非常有限，而且这些序列中大多会合在少数植物种类14，以是，这种要领只得当于遗传配景比力明晰或已有相干序列公布的药用植物。2通过构建的DNA文库挑选这种要领要求先构建DNA克隆文库或DNA文库，然后从文库中随机选出多少克隆，将各克隆插入片断斑点印迹在杂交膜上(如硝酸纤维膜、尼龙膜)，用标识表记标帜的本种基因组和其他种基因组的总DNA为探针别离举行斑点杂交，选择与本种基因组杂交时杂交信号强，而与其他基因组杂交时无杂交信号的克隆，该克隆的插入序列即为本种基因组的特异序列。这种要领可以一次挑选大量克隆，能得到相称数目的探针，重要题目是构建DN

6、A库历程比力繁琐，耗时费力，文库质量也会影响挑选结果。再是假设从DNA文库中挑选，因DNA是切除了内含子的DNA序列，而许多内含子自己在种间具有高度多态性如rDNA中IST序列，这些序列的切除会低落种特异性探针的挑选服从。3从nrDNA挑选因布局和成效上的差异，植物基因组差异部位的序列变异速率很不同等，一样平常环境编码区比力守旧，而非编码区序列因其成效上的限定较少,比编码区表示出更快的进化速率，差异种间各编码序列或非编码序列的变异方法和速率也是千差万别。植物细胞核中编码rRNA的基因分编码区和非编码区，此中编码区的18S与5.8S，5.8S与26S基因间被两个非编码区ITS1和ITS2所隔断如

7、图1所示。它们配合构成一转录单元顺反子(istrn)，顺反子高度重复(几百至几千次),以串联的方法摆列于核染色体上,而且这些核糖体RNA顺反子拷贝表示出高度的均一性(hgenEity)18。据此特性，可按照守旧区序列方案引物，扩增出易变异区DNA片断，通过对扩增产物测序阐发后，从中挑选出可做为种特异性探针的寡核苷酸序列19。3.1ITS(内转录隔断区)高等植物中nrDNA序列差异重要表示在ITS、ETS及IGS等非编码区上。被子植物中ITS序列既具有核苷酸序列的高度变异性又有长度上的守旧性。有研究表白18：被子植物大多数科属其ITS序列的种间差异值为1.2%10.2%，属间差异值为9.6%28

8、.8%，这对体系发育研究来说都是较符合的范畴，也得当从这些序列中挑选种特异性探针。ZhangYB等20将16个差异种属石斛的ITS1-5.8S-ITS2序列结实于玻片上制作了基因芯片，并用荧光标识表记标帜的ITS2序列作为探针,可检测出5种已被载入?中国药典?的石斛。该基因芯片还可检测出含有9种差异的中药材复方中的石斛。刘建全等21从市售“藏茵陈药材中提取DNA,PR扩增ITS1-5.8SrDNA-ITS2整个片断，扩增产物直接测序得到约700bp片断，接纳排序和体系发育阐发软件阐发“藏茵陈原植物的亲缘干系，据此方案的特异性分子快速断定试剂盒可对市场上的藏茵陈举行检测。3.226SrDNAnr

9、DNA编码区比力守旧，但此中有些可变区，差异的植物类群，其可变区变异率有很大差异。对付变异率大的类群，可以据此从中挑选到区分DNA探针。为了对差异种的贝母举行区分，香港都会大学及香港理工大学的研究者22方案了一种基因芯片可有用地对差异种的贝母举行区分。他们起首提取9种贝母球茎的基因组DNA，用引物对(上游引物5-GAGTGGGTTGTTTGGGA-3；卑劣引物5-GTATTGAGGGAAATT-3)对其26SrDNA基因D2与D3区举行扩增和测序，从其多态性区段方案了种种属特异性寡核苷酸探针，然后将差异种属寡核苷探针点置于经多聚赖氨酸处置惩罚包被的芯片。用来自差异种贝母的荧光素标识表记标帜的P

10、R产物与DNA芯片举行杂交，可在芯片特定位置检测到差异种贝母的荧光信号从而到达区分差异贝母的目的。陈月琴等23从采自陕西秦岭和广东天然庇护区的杜仲中提取总DNA，PR扩增产物与质粒载体PTZ19毗连，Sanger停顿法测定26SrDNA片断，接纳盘算机阐发软件Pgene610比力了金缕梅、栓皮栎、水青树、领春木及前人测定的8莳植物的同源序列，寻出其特性性核苷酸序列，为进一步开展杜仲的埋头性核酸分子探针研究奠基基矗从上述例子可以看到有些探针的是从rRNA编码区基因挑选出来，因这些区段的守旧性，在差异品种间的变革比力有限，难于挑选到有较大差异的长探针，对有些类群的植物乃至难于见效，如需区分的种类较

11、近缘时，从非编码区挑选大概会得到更好的结果。4从叶绿体DNAatK，trnL基因挑选如今常用于生药阐发的叶绿体基因组中的基因片断有核酮糖-1,5-二磷酸酯羧化酶基因(rbL)，编码成熟酶基因(atK)，编码RNA聚合酶B亚基基因(rp)，编码tRNA-lysine基因(trnL)，编码核糖体大亚基卵白16基因(rpl16)，编码核糖体小亚基卵白4基因(rps4)等26。此中atK基因在叶绿体基因组中的全部编码卵白基因中进化速率最快，常被用来研究被子植物科内程度的近缘干系研究中。再就是trnL基因，trnL基因内有三段非编码区，由于不受成效的限定，其进化速率大于成效编码区，如今被普及用于植物体系

12、学研究，也可以作为种特异性探针挑选的目的区段。如今还未见从叶绿体基因中挑选中药区分探针的报道，但应用其相干序列举行区分的事例许多，如章群27运用PR产物直接测序法测定杜仲原植物atK基因序列，通过lustal软件将其与GenBank中同源序列举行排序比力，创造32个特异性位点和一个杜仲所独占的GA插入序列，结论以为atK基序列的测序阐发可成为杜仲正品断定的有用本领。5从差减DNA克隆库中挑选按捺差减杂交法是Diathenk等28所创立，最初是应用于创立差异DNA文库，它是一种在差减DNA和RDA的底子上生长起来的基于PR的差异基因表达挑选要领。其根本原理是利用链内退火优于链间退火，比链间退火更

13、不变，从而使非目的序列片断两头反向重复序列在退火时产生雷同于“锅柄的布局，无法与引物配对，从而选择性地按捺了非目的片断的扩增，而差异片断得到富集。李同祥29利用该要领举行石斛区分DNA探针的挑选其历程见图2。起首得到两种石斛之间差减片断，然后选部门差异片断克隆别离和全部实行石斛的总DNA杂交，从中挑选出能与同种石斛DNA杂交而与别的种DNA不克不及杂交的克隆作为该种石斛专属DNA探针，将这些探针点在尼龙膜上制成微阵列，可敏捷而快速地区分出迭鞘石斛(D.aurantiauKerr)，金钗石斛(D.nbileLind.)，铁皮石斛(D.finaleKiuraetig)，鼓糙石斛(D.hrystxu

14、Lindl.)，流苏石斛(D.fibriatuHk)。因按捺差减杂交法的挑选目的基因是整个基因组，以是可以得到大量的探针，而且可以得到长碱基序列的探针，选择更近缘的种做为Driver有利于进步差减克隆中种特异性探针的比例，从而进步挑选服从，不敷之处是历程比力庞大，各步调反响条件难于掌握。6利用RAPD、AFLP分子标识表记标帜构建探针RAPD、AFLP分子标识表记标帜不单可以直接用来举行中药材的区分和药材道地性断定如Sha等30用RAPD扩增产物能有用地区分人参、西洋参、三七及其伪品；胡珊梅等31用RAPD技能探究泽泻道地药材与非道地药材之间遗传变异的巨细，并创立了道地药材的品格断定要领，还可

15、以通过接纳RAPD，AFLP多态性产物，克隆后作为RFLP探针32或作为挑选人工染色体文库(BA、YA文库)的特异性探针33，或对多态性产物举行测序，方案特异性引物探针34，用于中草药的区分。此要领涉及4个步调:DNA抽提；RAPD或AFLP扩增；特异性条带的接纳测序；探针的方案和验证。庄南生等35应用AFLP标识表记标帜技能得到了甘蔗祖亲种的AFLP特异片断478条，对此中部门AFLP特异片断通过斑点杂交和Suthern杂交阐发，挑选出了5个甘蔗属特异性探针，2个斑茅特异性探针。通过RAPD或AFLP的要领不方案引物，要领上比力简朴省事，但得到的探针数目有限，许多环境难以得到探针。综上所述，中药区分种特异性探针可以从多种途径得到，可以按照特定的方案选择有用的挑选途径。必要指出的是某DNA同源区段具多态性并不代表能从此中挑选出