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文档简介

1、第九章 PCR技术及其在医学上的应用第九章 PCR技术及其The Nobel Prize in Physiology or Medicine 1993for contributions to the developments of methods within DNA-based chemistry Michael Smith1944 -1932 - 2000La Jolla, CA, USA Kary B. Mullis University of British Columbia Vancouver, Canada for his invention of the polymerase c

2、hain reaction (PCR) methodfor his fundamental contributions to the establishment of oligonucleotide-based, site-directed mutagenesis and its development for protein studiesThe Nobel Prize in Physiology 一、PCR基本原理DNA模板变性:95左右高温变性单链DNA模板与引物退火:引物与模板形成复合物的几率DNA分子自身的复性引物的延伸一个PCR循环即“变性退火延伸”经过30个左右的循环后,PCR的

3、扩增倍数为(1+x)n, x=75%, n为循环数第一节 PCR原理与特点一、PCR基本原理DNA模板变性:95左右高温变性第一节 BABBABAABABABABA靶序列未扩增的DNA循环1变性退火延伸循环2变性、退火延伸A上游引物B下游引物PCR示意图5 端是人工合成的引物,是特定的,3 端没有固定的终止点特定的的扩增产物在第2个循环中出现,以后快速扩增,成为主要扩增产物BABBABAABABABABA靶序列未扩增的DNA循环1变BBAABABAABBABAABBABBAABABABA循环3变性、退火延伸n个循环后,5 端是特定的人工合成的引物,3 端没有固定的终止点的DNA链扩增量为2n。

4、BBAABABAABBABAABBABBAABABABA循环Taq聚合酶的性能模板DNA的拷贝数底物dNTP浓度其他多种因素30个循环后出现“平台效应” 平台效应出现的早晚取决于:Taq聚合酶的性能30个循环后出现“平台效应”二、PCR技术的特点高度的敏感性:是最主要的特点,25个循环可扩增106倍,它可对单拷贝、单根头发、一滴血等微量标本进行分析高度的特异性:取决于2个引物设计的好坏,依赖于引物与模板结合的正确性,退火温度操作简便、快捷适用样品的广泛性二、PCR技术的特点高度的敏感性:是最主要的特点,25个循环第二节 PCR系统的组成及PCR最适条件耐热DNA聚合酶寡核苷酸引物dNTPPCR

5、反应缓冲液模板DNAPCR循环数易发生的问题及解决方法第二节 PCR系统的组成及PCR最适条件耐热DNA聚合一、耐热DNA聚合酶必需金属离子 Mg2+ Mg2+ Mg2+ Mg2+3 5 外切活性 5 3 外切活性 逆转录活性 (Mn2+) (Mn2+) 未定 未定耐受100 该酶的出现使PCR操作大大简化,克服了以前每一循环反复加Klenow酶的缺点各种耐热DNA聚合酶的特性Taq Tth VENT Sac一、耐热DNA聚合酶必需金属离子 Mg2+ Taq DNA聚合酶的种类天然酶-嗜热水生菌分离纯化基因工程酶-Amlpi TaqTM5 3 DNA聚合酶在Mn2+存在下,逆转录酶活性最佳有5

6、 3 外切酶活性无3 5 外切酶活性,无校正功能PCR产物末端加1个非模板依赖性碱基,优先为A,是TA克隆的基础Taq DNA聚合酶的特性Taq DNA聚合酶的种类天然酶-嗜热水生菌分离纯化5 TA克隆定义 利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在7075活性高),使PCR产物的3末端加一个A的粘性端,将其直接克隆至3粘性末端含一个T的线性克隆载体中.35T载体35载体T3535AAPCR产物TA克隆定义 利用嗜热聚合酶如Taq聚合酶的模板非依赖TA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+335PCR产物AA5T载体TT5533连接转化蓝白筛选校正聚合酶平端PCR产物Taq酶

7、dATPTA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+335PCR二、寡核苷酸引物引物长度在1530个碱基,人基因组有3109bp,19mer引物:419 1011中重复1次.引物的碱基的分布是随机的, 避免5个以上的嘌啶和嘧啶的连续排列, 尤其3 不应有连续3个G或C避免两引物间的互补,特别是3 端引物自身不应有连续超过3个bp的互补序列引物的3 端不能有任何修饰, 3 决定产物的特异性引物的5 端限定PCR产物的长度, 5 端可进行修饰引物与非扩增序列同源性应70%或连续8个互补扩增编码区中,引物3 端不要终止于密码子的第3位引物的设计直接关系到PCR的特异性与成败引物的设计原则-现有引物设计

8、程序或软件二、寡核苷酸引物引物长度在1530个碱基,人基因组有31PCR反应引物的常用浓度范围 PCR反应中引物的浓度是1mol/L 在100l中引物的量为25100 pmol, 假如用25mol/L浓度的引物贮备液只需加1 4lPCR反应引物的常用浓度范围 PCR反应中引物的浓度是三、dNTPdNTP是dATP,dCTP,dGTP,dTTP的总称dNTP在50次循环中是稳定的dNTP在PCR中的常用浓度是20200mol/L试剂公司已将其pH调至7.0 要避免反复冻融, 分装冻存于-20每种贮存液浓度为5 10mmol/L, 一般为10 mmol/L, 4种合并后浓度即为2.5 mmol/L

9、100l的PCR反应中, 假如用各2.5 mmol/L浓度的dNTP混合液贮备液只需加8l注意Mg2+浓度与dNTP浓度之间的关系三、dNTPdNTP是dATP,dCTP,dGTP,dTTP四、PCR反应缓冲液Tris-Cl(pH8.8)KCl(50mmol/L)或(NH4)2SO4(25mmol/L):促使引物退火MgCl2(25mmol/L):影响酶活与精确度,产物的特异性明胶(5%)或BSA或Tween-20:稳定酶活性甲酰胺(5%):使引物与模板特异性配对四、PCR反应缓冲液Tris-Cl(pH8.8)五、模板DNA来源:广泛要求:待扩增部分需部分纯化用量:ng的量克隆DNA,g水平的

10、染色体DNA抽提方法:简单的水煮沸法 去垢剂裂解细胞蛋白酶消化蛋白有机溶剂抽提乙醇沉淀核酸扩增产物长度:检测性的长度一般为500bp (100 300bp为好);克隆片段则不受此影响五、模板DNA来源:广泛六、PCR循环数其他参数选定后, PCR循环数主要取决于模板DNA的浓度PCR循环数一般为25 30六、PCR循环数其他参数选定后, PCR循环数主要取决于模板七、易发生的问题及解决方法假阴性假阳性PCR产物呈片状非特异性扩增易发生的问题七、易发生的问题及解决方法假阴性易发生的问题假阴性是否加入Taq聚合酶,酶活性如何?DNA解链是否充分,PCR仪在变性可否达到解链温度样品中有酶抑制剂,95

11、,10min使用多组分引物,作双重PCR解决方法假阴性是否加入Taq聚合酶,酶活性如何?解决方法假阳性设立阴性对照、空白对照避免操作污染避免阳性对照以检测样品的污染解决方法假阳性设立阴性对照、空白对照解决方法PCR产物呈片状减少聚合酶浓度增加退火温度减少循环数解决方法PCR产物呈片状减少聚合酶浓度解决方法非特异性扩增增加退火温度,减少退火时间及延伸时间降低引物与聚合酶浓度改变Mg2+的浓度解决方法非特异性扩增增加退火温度,减少退火时间及延伸时间解决方法第三节 PCR技术的发展外源基因的分离基因重组DNA测序构建克隆或表达载体定点突变检测某基因的多态性转座子插入位点绘图检测基因修饰PCR及其衍生

12、技术的应用第三节 PCR技术的发展外源基因的分离PCR及其衍生技术的TA克隆定义 利用嗜热DNA聚合酶如Taq DNA聚合酶的模板非依赖性末端转移酶活性(在7075活性高),使PCR产物的3末端加一个A的粘性端,将其直接克隆至3粘性末端含一个T的线性克隆载体中.35T载体35载体T3535AAPCR产物TA克隆定义 利用嗜热DNA聚合酶如Taq DNA聚合TA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+335PCR产物AA5T载体TT5533连接转化蓝白筛选校正聚合酶平端PCR产物Taq酶dATPTA克隆方法(一步PCR克隆)PCR扩增+335PCRPCR克隆技术PCR直接测序技术定量PCRPCR体

13、外定点突变PCR与突变的分子水平分析修饰PCR不对称PCR反转录PCR通用引物PCR套式PCRPCR及其衍生技术的种类单一特异性引物PCR随机引物PCR倒向PCR免疫PCR碱基替代PCR锚式PCRmRNA差别显示原位PCR膜结合PCR简并引物PCRPCR克隆技术PCR及其衍生技术的种类单一特异性引物PCR第四节 PCR技术在医学上的应用感染性疾病病原体的诊断和研究遗传病相关基因的检测恶性肿瘤的诊断和研究法医学研究在骨髓移植配型中的应用第四节 PCR技术在医学上的应用感染性疾病病原体的诊断和研一、感染性疾病病原体的诊断和研究对形态和生化反应不典型的微生物病原体的鉴定解决混合标本问题生长缓慢或难于

14、培养的病原体的鉴定难于鉴定的病原体诊断HIVHCV与HEVHPV结核杆菌其他病原微生物鉴定新病毒一、感染性疾病病原体的诊断和研究对形态和生化反应不典型的微生二、遗传病相关基因的检测巴氏水肿胎儿的产前诊断镰形细胞贫血杜氏营养不良症(DMD)甲型血友病胎儿性别鉴定二、遗传病相关基因的检测巴氏水肿胎儿的产前诊断巴氏水肿胎儿综合征-地中海贫血中最严重的一种。4个-珠蛋白基因全部缺失(1条染色体应有2个珠蛋白基因),-珠蛋白形成4,即Hb Barts,对氧亲和力极高,常致胎儿窒息死亡。广东、广西多发巴氏水肿胎儿综合征-地中海贫血中最严重的一种。巴氏水肿胎儿的产前诊断设计1对引物PCR扩增-珠蛋白基因。同

15、时增加1对引物扩增-珠蛋白基因作内对照正常胎儿可扩增出136bp片段巴氏水肿胎儿不能扩增136bp片段巴氏水肿胎儿的产前诊断设计1对引物PCR扩增-珠蛋白基因。镰形细胞贫血原因:-珠蛋白链第6位的GAGGTG,造成GluVal所致。设计一对引物PCR扩增可得294bp,Oxa NI消化,电泳294191103bpAA:正常人BB:纯合子病人CC:杂合子病人镰形细胞贫血原因:-珠蛋白链第6位的GAGGTG,造成G杜氏营养不良症(Duchenne muscular dystrophy, DMD)男性常见的致死性X性连锁隐性遗传病以往检测基因缺陷方法:Southern 印迹杂交缺点:须用10余种探针

16、,操作费时,同位素用量大,所需 DNA量多,难于适应产前诊断的要求PCR方法:设计9对引物,用于扩增9个易缺失区,一次PCR同时扩增,某个片段无扩增则说明该段外显子缺失。针对可疑的男性胎儿进行DNA检测。优点:方法简单,快速,便于临床使用。杜氏营养不良症(Duchenne muscular dys甲型血友病最常见的遗传病凝血功能障碍所致的出血性疾病,为X性连锁隐性遗传病,是F基因缺陷所致临床无满意治疗措施,检出携带者及产前诊断,防止婴儿出生是降低发病率的主要措施。首先明确胎儿性别,女性不必作基因诊断,男性可作下列PCR检测甲型血友病最常见的遗传病凝血功能障碍所致的出血性疾病,为X性甲型血友病P

17、CR方法:设计1对引物,扩增F 第18外显子内142bp,内含Bcl I。1429943bpAA:正常胎儿BB:男性有病胎儿PCR产物的Bcl I酶切后电泳结果甲型血友病PCR方法:设计1对引物,扩增F 第18外显子内胎儿性别鉴定预防性连锁遗传病胎儿的出生应用切不可滥用,以免导致胎儿出生性别比例失调! 性连锁遗传病的分析法医学的个人鉴定(如犯罪人员) 性器官发育异常的基因检测(包括一些运动员的性别鉴定) 指导性矫形手术出生后的性别鉴定应用胎儿性别鉴定预防性连锁遗传病胎儿的出生应用切不可滥用, 性连1990年确定决定人类性别的基因位于Y染色体短臂的1A1上,即SRY基因(sex-determin

18、ing region of the Y),染色体上如缺SRY,即发展成女性。设计扩增人SRF基因和X、Y同源序列的2对引物进行PCR355289bpMM:maleFF:female590鉴定诊断率100%1990年确定决定人类性别的基因位于Y染色体短臂的1A1上,三、恶性肿瘤的诊断和研究恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测癌基因、抗癌基因缺失与点突变的研究肿瘤相关病毒基因的研究三、恶性肿瘤的诊断和研究恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞1. 恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测某些白血病与特定的染色体的易位或基因重排有关如95%CML都存在ph染色体, 产生t(9:22),形成be

19、r/abl融合基因, 转录成嵌合mRNAPCR检测: 设计1对引物扩增ber/abl嵌合mRNA.本法可检测1个ph阳性细胞/105正常细胞该法也可用于淋巴瘤t(14:18)、(q32:q21)1. 恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测某些白血病1. 恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测PCR法可检测15个肿瘤残留细胞/104105正常细胞PCR为肿瘤的诊断、预后判断、微量残留细胞提供了快捷、正确的方法1. 恶性肿瘤分子标记的检测及肿瘤残留细胞的监测PCR法可以往检测缺失方法:较大缺失在显微镜下分析;微小缺失用印迹杂交PCR法检测:简单引物设计方法:小缺失,设计1对引物分别与缺失两侧的序列互补;大缺失,在缺失区内设计1对PCR检测缺失: 小缺失样品,扩增片段长度变短;大缺失样品,无靶DNAPCR扩增产物PCR检测突变方法:PCR-SSCP、引物竞争PCR和PCR直接测

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