齐鲁医学酶工程3酶的分离纯化

1、第三章 酶的分离纯化2021/9/301酶分离纯化的目的 酶分离纯化的目的是使酶制剂产品达到应用所需的纯度。2021/9/302分离纯化过程包括3个基本步骤：1 抽提2 纯化3 制剂2021/9/303Crude product concentration versus selling price (Dwyer, 1984)2021/9/304某些生化物质在原料液中的浓度与价格的关系(1984年) 物质名浓度(C)价格(P，)尿激酶51053108荧光素酶81032106胰岛素41019104头孢菌素10102乙醇110231012021/9/305在分离纯化中必须注意：1 防止酶的变性失活；

2、2 在分离纯化过程中的每一步都 应检测酶的活性，以确定酶的 纯化程度和回收率。2021/9/306第一节 酶活力的测定几个名词1 酶活力或酶活性2 酶活力单位3 mol催化活性（分子活性）和转换 数（催化中心活力)4 酶的比活力2021/9/307酶活力（又称酶活性） (enzyme activity)（IU/g或IU/mL)指酶催化一定化学反应的能力；用在一定条件下，所催化的反应初速度来表示；是研究酶的特性，酶制剂生产应用以及分离纯化时的一项必不可少的指标。2021/9/308酶活力单位(enzyme activity unit)表示酶活力大小的尺度；一个国际单位（IU）是指在特定条件下（2

3、5 0C），每分钟内转化1mol底物或催化形成1mol产物所需的酶量一个Kat是指每秒钟内转化1mol底物所需的酶量，1 Kat = 6107 IU。2021/9/309mol催化活性（分子活性）和转换数（催化中心活力） mol催化活性是指单位时间内，每个酶分子所转换的底物分子数目；转换数（Kcat)是指酶分子中每个活性中心所转换的底物分子数目。如果酶分子中只有一个活性中心，那么mol催化活性与转换数相等，如果酶分子中含有n个活性中心，那么转换数则为mol催化活性除以n 。2021/9/3010酶的比活力（specific activity)酶的比活力是酶纯度的量度，是指单位重量酶蛋白所具有的

4、酶活力，单位为IU/mg。比活力越大，酶纯度越高。2021/9/3011酶活力的测定方法：终止反应法和连续反应法。2021/9/3012终止反应法在恒温反应系统中，每隔一定时间，取出一定体积的反应液，用强酸强碱或SDS以及加热等使反应立即停止，然后用化学法、放射性化学法或酶偶联法分析产物的形成量或底物的消耗量。这是最经典的酶活力测定方法，几乎所有的酶都可以根据这一原理设计出具体的测定方法。2021/9/3013连续反应法无须终止反应，而是在酶反应过程中用光化学仪器或电化学仪器等来监测反应的进行情况，对记录结果进行分析，然后计算出酶活力。2021/9/3014酶不可逆失活的原因和机理2021/9

5、/3015蛋白质（酶）的失活机理2021/9/3016蛋白质不可逆失活的原因蛋白酶水解或自溶作用表面活性剂和去垢剂聚合作用氧化作用机械力变性剂重金属离子和巯基试剂冷冻和脱水热极端pH蛋白质不可逆失活脲和胍高浓度盐螯合有机溶剂辐射作用2021/9/3017 蛋白质的稳定化2021/9/3018蛋白质稳定化蛋白质稳定化途径如何防止蛋白质的可逆伸展如何防止蛋白质不可逆失活反应发生2021/9/3019稳定蛋白质（酶）的方法2021/9/3020酶分离的一般流程 原料液细胞分离(离心，过滤)细胞胞内产物路线一路线二细胞破碎碎片分离路线一A路线一B清液胞外产物粗分离(盐析、萃取、超过滤等)纯化(层析、电

6、泳)脱盐(凝胶过滤、超过滤)浓缩(超过滤)精制(结晶、干燥)包含体溶解(加盐酸胍、脲)复性2021/9/3021第二节 酶溶液的制备2021/9/3022酶溶液的制备： 把酶从生物原料中抽提出来，作成酶溶液 酶溶液的制备包括：材料预处理及细胞破碎、抽提、净化脱色、抽体液的浓缩等几个步骤。2021/9/3023一、材料预处理及细胞破碎材料预处理：酶蛋白在细胞内外的分布有三种情况：胞外酶，胞内酶（溶酶和晶酶）。2021/9/3024微生物胞外酶 可以用盐析或有机溶剂沉淀等从发酵液中沉淀成酶泥胞内酶 要先收集菌体，经细胞破碎后提取2021/9/3025动物材料 应先剔除结缔组织和脂肪组织等植物材料

7、应去皮等以免单宁等物质着色污染2021/9/3026细胞破碎： 物理和化学两大类方法2021/9/30271、物理破碎： 研磨（手磨，球磨和石磨）， 机械捣碎（匀浆器和高速组织捣碎器等）， 高压法， 爆破性减压法， 专用波振荡， 快速冷冻融化法等。2021/9/30282、化学破碎： 渗透作用 自溶： 酶处理 表面活性剂2021/9/3029（I）渗透作用 将指数生长期的菌体用缓冲液洗净，并悬浮于含蔗糖和EDTA的稀Tris缓冲液中，离心，加入 MgCl2剧烈搅拌，可使一些水解酶从细胞内释放出来。2021/9/3030（II）自溶 向菌体中加入醋酸乙酯，甲苯，乙醚以及氯仿，使细胞渗透性改变保持

8、一定时间后可以使细胞自溶；2021/9/3031（III）酶处理 用溶菌酶专一性地分解原核微生物细胞壁，使胞内酶释放2021/9/3032（IV）表面活性剂 膜结合的晶酶在细胞破碎后很难溶解，常借助于表面活性剂与脂蛋白形成微泡，使之溶解。2021/9/3033二、抽 提大多数酶蛋白是属于球蛋白，因此，可用稀盐、稀碱或稀酸的水溶液进行抽提；抽提液的具体组成和抽提条件的选择取决于酶的溶解性、稳定性以及有利于切断酶与其它物质的连结。2021/9/30341、提取的主要方法：（1）盐溶液提取（2）酸溶液提取（3）碱溶液提取（4）有机溶剂提取2021/9/30352、酶提取过程的注意事项 pH的选择 盐

9、的选择 温度的选择 抽提液用量 其它2021/9/3036pH的选择首先考虑酶的稳定性；其次应 远离等电点；一般选择pH4-6 为宜。2021/9/3037盐的选择 大多数酶在低浓度的盐溶液 中有较大的溶解度，一般选 择等渗盐溶液，如0.02-0.05 mol/L的磷酸缓冲液或0.15 mol/L的NaCl等。2021/9/3038温度的选择 一般控制在0-4 0C，如果酶 比较稳定可以例外。2021/9/3039抽提液用量常采用材料量的1-5倍2021/9/3040其它加入蛋白酶抑制剂、半胱 氨酸或细胞色素C等，来 稳定抽提系统。2021/9/3041三、酶溶液的絮凝、净化与脱色2021/9

10、/3042絮凝由于发酵液黏度较大，细胞表面电荷排 斥以及多糖蛋白质等大分子物质形成的 水化层等给酶溶液的离心或过滤带来困 难；因此要用絮凝剂进行处理。絮凝剂：多种类型 无机：如醋酸钙和磷酸钙等 有机：如聚丙烯酰胺等 天然高分子：如壳多糖等2021/9/3043过滤或离心净化通过絮凝剂处理后的酶溶液经过离心或过滤将细胞碎片等固性物和杂蛋白，粘多糖，核酸以及脂类等大分子物质去除。2021/9/3044脱色酶的工业生产中，常用的脱色剂为活性炭，活性炭通过吸附色素而脱色；活性炭用量一般为0.1%-1.5%。2021/9/3045四、酶溶液的浓缩 冷冻干燥法 蒸发法： 超过滤法： 胶过滤法： 干燥202

11、1/9/3046冷冻干燥法先将酶溶液冻成固体，然后在真空状态下使水分子从固体表面直接升华。2021/9/3047蒸发法目前工业上采用较多的是薄膜蒸发法，在高度真空状态下使酶溶液转变为极薄的液膜，通过加热而迅速汽化，经旋风式汽液分离器达到浓缩的目的。2021/9/3048超过滤法将酶溶液通过只允许小分子物质通过的微孔滤膜，大分子的酶蛋白被截留而达到浓缩的目的。2021/9/3049胶过滤法利用Sephadex G-250或G-50吸水膨胀，而酶蛋白被排阻在胶的外面。2021/9/3050其它方法吸水剂如用聚乙二醇(PEG)处理小量样品。2021/9/3051干燥将固体、半固体或浓缩液中水分（或其

12、他溶剂）除去一部分，以获得含水量较少的固体过程。方法：真空干燥、冷冻干燥、喷雾干燥、气流干燥、吸附干燥2021/9/3052第三节 酶分离纯化的基本过程2021/9/3053一、酶分离纯化方法的选择 目前酶的分离纯化方法都是根据酶与杂蛋白的性质差异而建立的，在选择分离纯化方法时，要考虑以下几个方面：首先对待纯化的酶的理化性质有比较全面的了解；以酶活力和比活力为标准，判断所选择的方法是否得当；严格控制操作条件，防止酶的变性失活。2021/9/3054选择生物分离方法的依据1 物理化学性质2 生物体系的特性3 能用作分离和纯化依据的蛋白质性质2021/9/3055 1 .物理化学性质 分子大小、分

13、子量、分子体积、极性、偶极矩、熔点、沸点、汽化热、离子电荷、溶解度参数、折射率、表面张力、介电常数、密度、粘度、酸碱强度、pK值、等电点(pI)等等。物质之间得以分离的主要依据就是组分间的物化性质的差异。 在涉及具有生物活性物质的体系中，有关这方面的数据与化工产品相比要少得多，严重影响了生物分离过程的有效进行。因此，生物体系的物化性质的研究应成为一个重点。2021/9/30562. 生物体系的特性 对一些有生物活性的物质，不是能够用一般的物化性质来表达的，这就需要了解这些物质的生物特性，特别要知道影响生物特性变化的条件和这些物质失活的因素，包括溶剂、pH值、温度等等。这种保持生物质特性不至于改

14、变的措施就是所谓的稳定性维持。2021/9/30573.能用作分离和纯化依据的蛋白质性质 能从混合物中分离和纯化出一种蛋白质是因为不同蛋白质有着不同的物理和化学性质。这些性质是由于蛋白质的氨基酸数目和序列不同造成的。连接在多肽主链上的氨基酸残基可以是带正电荷的或带负电荷的、极性的或非极性的、亲水性的或疏水性的。 此外，多肽可折叠成非常确定的二级结构(螺旋、折叠和各种转角)和三级结构，形成独特的大小、形状和残基在蛋白质表面的分布状况。利用待分离蛋白质与混合物中其它蛋白质之间在性质上的差异，即能设计出一组合理的分级分离步骤。2021/9/3058酶分离纯化方法 根据分子大小建立的分离纯化方法 根据

15、溶解度建立的分离纯化方法 根据电荷性质建立的分离纯化方法 根据亲和作用建立的分离纯化方法 根据稳定性差异建立的分离纯化方法2021/9/3059一、根据分子大小建立的分离纯化方法 透析 超过滤 离心 凝胶过滤等。2021/9/30601、透 析(Dialysis)法：过程：将酶溶液装入透析袋中，放入蒸馏水或稀缓冲液中，小分子物质通过透析袋进入水或缓冲液中，而蛋白质被截留在透析袋中；透析袋类型：有两种，再生纤维素膜透析袋和纤维素酯透析袋。有多种型号和规格，主要参数是分子量截留值（1102D）；商品名为spectrapor等。透析袋的预处理：干燥的透析袋在制备过程中曾用10%甘油处理过，只要浸泡湿

16、润和蒸馏水洗涤即可使用；必要时可用10mmol/L 碳酸氢钠，50%乙醇和10mmol/L EDTA处理后，再用蒸馏水洗涤。2021/9/3061透析袋酶溶液蒸馏水2021/9/3062透析装置和过程2021/9/30632、超过滤 利用压力或离心力强行使溶质按大小形状的差异分开，将所需的酶分子被滤膜截留，而其它较小的分子随溶剂被压到膜的另一侧。2021/9/3064超滤膜制备超滤膜的材料多是高分子聚合物（如聚砜类，聚四氟乙烯等；目前有圆形和卷式等多种超滤膜类型；主要参数是截留分子量，耐受压力和滤速和有效过滤面积等；主要商品型号有Amicon Diaflo系列等。超滤器类型有管式，中空纤维式，

17、螺旋卷绕式和平板式四种类型。2021/9/3065加压酶溶液超滤膜支持栅板超滤液超滤装置2021/9/30663、离心法离心是借助于离心机旋转所产生的离心力，使不同大小和不同密度的物质分开的技术。2021/9/3067（1）离心机的种类和用途（2）沉降系数 S（3）离心方法的选择 差速离心 密度梯度离心 等密度离心（4）离心条件的确定 离心力 离心时间 离心温度和pH值2021/9/3068梯度离心密度梯度在离心管内的分布是管底的密度最大,向上逐渐减小蔗糖便宜，纯度高，浓溶液（60，w/w）密度可达1.28g/cm3。聚蔗糖的商品名是Ficoll，它是由蔗糖和1- 氯-2,3-环氧丙烷合成的高

18、聚物，Mr 约400000。 需要高密度和低渗透压的梯度时，可用Ficoll代替蔗糖。2021/9/30694、凝胶过滤法原理：又称分子筛层析，在层析柱中填充凝胶介质，加入待分离的酶溶液，然后用适当的缓冲液洗脱，样品自上而下扩展，大于凝胶孔径的分子不能进入胶粒内部而从胶粒间空隙扩展，下移速度较快，而小于凝胶孔径的分子进入胶粒内部，下移速度较慢，经过一定时间后不同大小分子按先大后小的顺序从层析柱中流出。2021/9/3070凝胶过滤2021/9/3071凝胶过滤2021/9/3072Tubes march in from left A280Fraction #2021/9/3073部分使用的担体

19、 目前使用最广泛的担体材料： 交联后的葡聚糖凝胶 聚丙烯酰胺 琼脂 其它物料2021/9/3074二、根据溶解度建立的分离方法1、盐析(Salting Out)法2、降低介电常数法（有机溶剂沉淀 法） 3、等电点沉淀法4、共沉淀法5、选择性沉淀法：2021/9/30751、盐析法 最常用的是硫酸铵。盐浓度以饱和度表示，饱和盐溶液的饱和度为100%。调整盐浓度有两种方法：加入饱和硫酸铵溶液（蛋白质溶液体积不大时）和直接加入固体硫酸铵（蛋白质溶液体积较大时）。加入饱和硫酸铵：100ml溶液中，由饱和度S1变为S2，应向其中加入的饱和硫酸铵溶液的ml数 V= V0（S1-S2）/（1-S2）。直接加

20、入固体硫酸铵可以直接查“调整硫酸铵溶液饱和度计算表”。2021/9/30762、降低介电常数法（有机溶剂沉淀法） 降低介电常数方法 在酶溶液中加入与水互溶的有机溶剂，可以降低介电常数，使酶分子间的静电引力增加而发生沉淀。 2021/9/3077影响介电常数的主要因素： 温度 有机溶剂 离子强度 pH值：2021/9/3078温度：在0下进行操作；有机溶剂必须冷至-15 -20，边搅拌边缓慢加入，沉淀析出后迅速离心分离，并用预冷缓冲液溶解沉淀。2021/9/3079有机溶剂：常用的有机溶剂有丙酮，乙醇，甲醇，异丙醇等2021/9/3080离子强度大多数中性盐在低浓度时能增加酶蛋白的溶解并减少变性

21、，在有机溶剂沉淀中加入510% （0.05mol）的硫酸铵有助于提高分辨率。2021/9/3081pH值尽可能接近酶的等电点pI2021/9/30823、等电点沉淀法酶在等电点处容易发生沉淀2021/9/30834、共沉淀法一些大分子非离子型聚合物如聚乙二醇（PEG）,聚乙烯亚胺（PEI）单宁酸，硫酸链霉素以及表面活性剂（SDS）等在一定条件下可以直接或间接与蛋白质形成络合物而沉淀析出,再用适当的方法使酶溶解出来。2021/9/30845、选择性沉淀法：有些多聚电解质可以在极低浓度下选择性地与某些酶结合而形成沉淀。如聚丙烯酸（PAA）可以与某些蛋白酶，溶菌酶和磷酸酯酶等形成沉淀。分离过程如下：

22、 PAA+酶 酶 PAA-酶+Ca 2+ PAA- Ca 2+ + 酶 PAA- Ca 2+ + SO4 2- CaSO4 + PAA2021/9/3085三、按蛋白质电荷性质设计的分离方法 1、吸附法（1）物理吸附法（2）羟基磷灰石法（3）离子交换吸附法-离子交换色谱法2 、电泳法（1）区带电泳（2）等点聚焦电泳（3）高效毛细管电泳（4）聚焦层析2021/9/3086（1）物理吸附法(不介绍)2021/9/3087（2）羟基磷灰石法羟基磷灰石是一种微晶型磷酸钙；一般认为其表面的钙离子和磷酸根离子与蛋白质带相反电荷的基团发生相互作用；在低盐和弱酸或中性条件下进行吸附；洗脱时提高离子强度；多采用

23、柱层析方式进行。2021/9/3088 （3）离子交换吸附法离子交换色谱法利用带电荷的离子交换剂为载体，将带相反电荷的蛋白质吸附，然后在一定条件下洗脱下来。 2021/9/3089离子交换层析过程：离子交换剂的预处理平衡装柱加样吸附洗脱洗脱液收集与相应检测离子交换剂的再生2021/9/3090离子交换剂一般由高分子支持介质（母体）和功能基团（离子交换基）两部分组成。2021/9/3091离子交换剂应满足下列要求：（1）有高度的不溶性，即在各种溶剂中进行交换时，交换剂不发生溶解（2）有疏松的多孔结构或巨大的表面积，使交换离子能在交换剂中进行自由扩散和交换（3）有较多的交换基团（4）有稳定的物理化

24、学性质，在使用过程中，交换剂不能因物理或化学因子的变化而发生分解和变形等现象。2021/9/3092离子交换剂的3种类型根据高分子支持介质的性质离子交换树脂离子交换纤维素离子交换球型多糖(如葡聚糖凝胶和琼脂糖凝胶等)。2021/9/30932、电泳法在直流电场中，由于各种蛋白质分子所带电荷不同，移动速度不同，形成各自的区带，用显色剂如Coomassie Blue染色后，可以在支持物上看到蛋白质的颜色谱带，每条带代表一种蛋白质。2021/9/3094基本原理 蛋白质是两性电解质，在一定pH下，可解离成带电荷的离子，在电场作用下可以向与其电荷相反的方向的电极泳动，泳动速度主要取决于蛋白质分子所带电

25、荷的性质、数量及颗粒的大小和形状。2021/9/3095 由于各种蛋白质的等电点（pI）不同，分子量不同，在同一个pH缓冲溶液中所带电荷不同，故在电场中的泳动速度也不同，利用此性质，可将混合物中不同蛋白质分离开，也可用其对样品的纯度进行鉴定。2021/9/3096双向电泳-12021/9/3097双向电泳-22021/9/3098双向电泳-32021/9/3099电泳法（1）区带电泳（2）等点聚焦电泳（3）高效毛细管电泳2021/9/30100（1）区带电泳在惰性支持物上进行电泳时样品中各组分迁移速度不同而分布成区带的一类电泳分离方法按支持物的物理性状可分为3种类型：膜电泳 粉末电泳凝胶电泳2

26、021/9/30101膜电泳以滤纸、聚酰胺薄膜，醋酸纤维薄膜等为支持物的一类电泳分离方法。2021/9/30102粉末电泳以淀粉、纤维素粉或硅胶粉等为支持物的分离方法。2021/9/30103凝胶电泳以聚丙烯酰胺为支持物，兼有分子筛效应。2021/9/30104区带电泳的优点分辨率较好设备简单操作方便2021/9/30105（2）等点聚焦电泳利用两性电解质在直流电场中形成一个连续的pH梯度，样品中各种蛋白质在各自的等电点在相应的pH区段聚集而达到分离的目的。2021/9/30106等电聚焦电泳2021/9/30107高效毛细管电泳毛细管电泳是在内径为25100m的石英毛细管中进行电泳，毛细管中

27、填充了缓冲液或凝胶。使用毛细管的一个优点是: 它减少了由于热效应产生的许多问题，因为管的孔径小，面积与体积之比大，这样可以提高热散失，有助于消除由于热引起的扩散增加而造成的对流和区带变宽，因此管中不需要加入稳定介质即可进行自由流动电泳。2021/9/301082021/9/30109聚丙烯酰胺凝胶电泳 聚丙烯酰胺凝胶电泳（polyacrylamide gel electrophoresis，PAGE）是以聚丙烯酰胺作为支持物的一种电泳方法。PAGE方法成了研究蛋白质和核酸等大分子物质的重要工具之一. 2021/9/30110实践中可根据不同目的选择所需的类型。一般单向PAGE多用于分离具有活性

28、的生物物质，而双向或梯度PAGE则宜用于较难分离鉴别的生物大分子物质。如果在PAGE时加入适量十二烷基磺酸钠（SDS）可用于测定蛋白质的分子质量；如果PAGE与等电聚焦相结合时，可用于分析蛋白质的等电点。 除这些用途外，PAGE还可用于制备少量的纯度高、有活性的生物大分子物质2021/9/30111 聚丙烯酰胺凝胶具有三维网状结构，电泳颗粒通过网状结构的空隙时受到摩擦力的作用，摩擦力的大小与样品颗粒的大小呈正相关。基本原理聚丙烯酰胺凝胶丙烯酰胺（acrylamide Acr）单体（monomer）N，N- 甲叉双丙烯酰胺（N,N- methylene- bis acrylamide，Bis）交

29、联剂（crosslinker）聚合交联2021/9/30112原理：当向蛋白质溶液中加入足够量SDS和巯基乙醇，SDS能破坏蛋白质分子中的氢键和疏水作用，使蛋白质变性而改变原有的构象，特别是强还原剂硫基乙醇的存在，使蛋白质分子内的二硫键还原，从而保证蛋白质与SDS结合形成带负电荷的蛋白质- SDS复合物。SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳2021/9/30113蛋白质在聚丙烯酰胺凝胶中电泳时，它的迁移率取决于 如果加入一种试剂消除电荷、形状等因素的影响，使电泳迁移率只取决于分子的大小，就可以用电泳技术测定蛋白质的分子量。净电荷分子的大小形状等因素2021/9/30114（SDS）的主要用途是蛋白质分子

30、量的测定蛋白质混合组分的分离蛋白质亚基组分的分析等2021/9/30115四、根据亲和作用建立的纯化方法2021/9/30116根据亲和作用建立的纯化方法由于酶对底物，竞争性抑制剂,辅酶等配体具有较高的亲和力，而其它杂蛋白对这些配体则没有或有很弱的亲和作用，因此，可以根据酶与杂蛋白对配体亲和力的差异，很容易地将酶分离出来。目前已经建立的方法有亲和层析法和亲和电泳法等。 2021/9/301171、亲和层析法亲和层析的核心是亲和吸附剂，它是由固相载体和能与目的酶专一可逆结合的配体共价结合而成的。将亲和吸附剂填充层析柱，让酶液流过层析柱，则目的酶就能迅速而选择性地吸附在亲和吸附剂上，用适当的溶液进

31、行洗涤，除去一些非专一性的杂蛋白后，再用浓度高的或亲和力更强的配体溶液进行亲和洗脱目的酶便可被洗脱出来。2021/9/30118亲和层析中的配体构成示意图 Matrix: for ligand attachment, should be chemically and physically inert. Spacer arm: improve binding between ligand and target molecule by overcoming any effects of steric hindrance.Ligand: molecule that binds reversibly to a specific target molecule or group of target molecules.2021/9/30119亲和体系的种类 体系类 型高特异性体系 抗原单克隆抗体荷尔蒙受体蛋白核酸互补碱基链段、核酸结合蛋白酶底物