实验三伪狂犬病抗体检测课件

1、实验四、伪狂犬病抗体检测（阻断ELISA)实验三伪狂犬病抗体检测1实验四、伪狂犬病抗体检测（阻断ELISA)实验三伪狂犬病抗酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked ImmunoSorbent Assay, ELISA) 将已知的抗原或抗体吸附在固相载体(聚苯乙烯微量反应板)表面，从而使酶标记的抗原抗体反应在固相表面进行，根据加入底物的颜色反应来判定是否有免疫反应的存在。 实验三伪狂犬病抗体检测2酶联免疫吸附试验(Enzyme-Linked Immuno一、实验目的了解ELISA的原理和类型掌握阻断ELISA操作程序实验三伪狂犬病抗体检测3一、实验目的了解ELISA的原理和类型实验三伪狂犬

2、病抗体检测二、实验原理抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持其免疫学活性；抗原或抗体可通过共价键与酶形成酶结合物，而此种酶结合物仍能保持其免疫学和酶学活性；酶结合物催化底物发生化学反应，根据颜色的有无和深浅判定抗原抗体反应的发生与否。实验三伪狂犬病抗体检测4二、实验原理抗原或抗体能以物理性地吸附于固相载体表面，并保持间接法（Indirect ELISA）阻断法（Block ELISA) 双抗体夹心法（Sandwich ELISA)竞争法（Competitive ELISA)实验三伪狂犬病抗体检测5间接法（Indirect ELISA）实验三伪狂犬病抗体检测（1）间接法测定抗体A. 将

3、抗原吸附于固相载体表面；B. 加抗体, 形成抗原-抗体复合物; C.加酶标抗体；D. 加底物。测定底物的降解量抗体量。实验三伪狂犬病抗体检测6（1）间接法测定抗体实验三伪狂犬病抗体检测6显色间接ELISA实验三伪狂犬病抗体检测7显色间接ELISA实验三伪狂犬病抗体检测7 （2）阻断法测定抗体A.将抗原吸附在固相载体表面; B. 先加待检血清（抗体）, 形成抗原-抗体复合物; C.再加酶标单抗；D. 加底物。实验三伪狂犬病抗体检测8 （2）阻断法测定抗体实验三伪狂犬病抗体检测8单抗血清？底物显色阻断ELISA实验三伪狂犬病抗体检测9单抗血清？底物显色阻断ELISA实验三伪狂犬病抗体检测9（3）双

4、抗体夹心法测定抗原A. 将抗体吸附于固相表面; B. 加待检抗原，形成抗原-抗体复合物; C. 加酶标抗体; E. 加底物。底物的降解量抗原量。 实验三伪狂犬病抗体检测10（3）双抗体夹心法测定抗原实验三伪狂犬病抗体检测10 （4）竞争法测定抗原A. 抗体吸附在固相载体表面; B. 同时加入酶标抗原和待测抗原，竞争结合抗体； 对照只加入酶标抗原； C. 加底物。对照孔与样品孔底物降解量的差未知抗原量。实验三伪狂犬病抗体检测11 （4）竞争法测定抗原实验三伪狂犬病抗体检测11酶标板，酶标仪包被缓冲液：0.025M pH9.6碳酸盐缓冲液猪伪狂犬病毒（PRV） 抗原样品稀释液： pH7.4 PBS

5、三、实验材料实验三伪狂犬病抗体检测12酶标板，酶标仪三、实验材料实验三伪狂犬病抗体检测12阴性对照（EP管中，已稀释）阳性对照（EP管中，已稀释）样品 待测猪血清（EP管中，已稀释）AP标记猪PRV单抗 酶标单抗（EP管中，已稀释）洗涤液：含0.05% Tween 20的0.01M pH7.4 PBS（青瓶）实验三伪狂犬病抗体检测13阴性对照（EP管中，已稀释）实验三伪狂犬病抗体检测13常用酶及底物常用酶底物反应后颜色辣根过氧化物酶（HRP）邻苯二胺（OPD）棕黄色碱性磷酸酶（AP）四甲基联苯胺（TMB）蓝色实验三伪狂犬病抗体检测14常用酶及底物常用酶底物反应后颜色辣根过氧化物酶（HRP）邻苯

6、底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液底物溶液：TMB（四甲基联苯胺），底物缓冲液，30% H2O2，新鲜配制终止液实验三伪狂犬病抗体检测15底物缓冲液： pH5.0磷酸盐柠檬酸缓冲液实验三伪狂犬病抗体1.抗原处理：2.抗原包被：取酶标板，加入100L/孔的抗原稀释液 4，18h取出包被好抗原的酶标板（4孔/组），甩干孔内液体以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次四、实验方法实验三伪狂犬病抗体检测161.抗原处理：2.抗原包被：取酶标板，加入100L/孔的抗3.加待测血清：标记各孔，加入相应液体100L/孔1234阴性待测阳性待测4.加单抗：37，30min甩干孔内液体以洗涤液（2

7、00L/孔）洗涤3次，3min/次各孔加入酶标单抗100L/孔37，30min5.显色：甩干孔内液体以洗涤液（200L/孔）洗涤3次，3min/次加入底物溶液100L/孔避光显色，10min,加终止液1滴6.观察结果实验三伪狂犬病抗体检测173.加待测血清：标记各孔，加入相应液体100L/孔1234取稀释好的被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入100l，置37温育30分钟。洗板：甩掉板孔中的溶液，每孔加入稀释好的洗涤液200l，静置3分钟倒掉，再在吸水纸上拍干，重复3次。每孔加酶标单抗100l，置37温育30分钟。洗板：同步骤2。显色与终止：每孔先加底物A液、再B液各1滴(50l)，混匀，

8、室温（18-25 ）避光显色10分钟后。终止：每孔加终止液1滴(50l) （0.25% 氢氟酸），终止反应。10分钟内测定结果。采用波长630nm的酶标仪测定OD值。结果判定：试验成立的条件是：阴性对照孔平均OD630值与阳性对照孔平均OD630值之差0.4。S=样品孔OD630值，N=阴性对照孔OD630值如果S/N比值0.6，样品判定为PRV抗体阳性;如果S/N比值0.7但 0.6，样品可疑;如果S/N比值 0.7，样品判定为PRV抗体阴性。实验三伪狂犬病抗体检测18取稀释好的被检血清2份和阴、阳性对照血清，每孔加入100l五、结果与分析阴阳性对照样品的OD630 ?S/N?，被检血清是阴/阳性？结果与预期的不符，可能的原因是什么？实验三伪狂犬病抗体检测19五、结果与分析阴阳性对照样品的OD630 ?实验三伪狂犬病预期结果阳性：无色阴性：蓝色1 2 3 4阳性阳性阴性被检单抗血清？底物显色被检？实验三伪狂犬病抗体检测20预期结果阳性：无色1 2 3 ELISA前血清样品37灭活30分钟。在ELISA的整个操作过程中，洗涤是非常重要步骤，目的在于防止引起非特异性吸附，洗涤时尽可能除去未结合的抗原及杂质，用力甩干。加入底物液后应室温避光，结果判断须在10分钟内。实验中保持安定，不要随意走动、