BcrAbl融合基因荧光定量RT-PCR诊断试剂盒说明书

1、Evaluation Warning: The document was created with Spire.Doc for .NET. PML/RAR融合基因荧光RT-PCR诊断试剂盒一、试剂盒采用荧光定量RT-PCR方法，快速、特异、灵敏、定量地检测临床白血病标本中PML/RAR融合基因的情况, 约有90%的急性早幼粒细胞白血病患者骨髓细胞和血细胞中会出现PML/RAR融合基因。因此检测PML/RAR融合基因已成为诊断急性早幼粒细胞白血病以及治疗后追踪残余白血病细胞的主要依据。二、试剂盒组成(20人份)RNA提取取液 （20mll /瓶瓶）1瓶Taq酶 （40l /管管）1管反应液I （

2、165l /管管）1管定量标准品品 （550l /管管）8管反应液III （165l /管管）1管DEPC H22O （5000l /管管）1管反应液 （350l /管管）1管去离子水 （111000l /管）1管逆转录酶 （25l /管管）1管三、检测步步骤 1标本采采集抽取外周血血5mll抗凝后后密封送送检，或或3mll新鲜骨骨髓标本本密封送送检。2标本处处理将5ml抗抗凝外周周血或33ml骨髓髓加入等等体积生生理盐水水稀释，取10ml离心管，先加入2ml淋巴细胞分离液，再取稀释好的标本5ml沿管壁缓慢加入，4静置5分钟后，2,000rpm离心15分钟，小心吸取白细胞层于1.5ml离心管中

3、，离心留沉淀，用生理盐水洗沉淀一次，沉淀加入0.5ml RNA提取液，充分混匀。室温静置5分钟，加入0.2ml氯仿，盖上管盖，用力振摇15秒，4静置2-3分钟，4 12,000rpm离心15分钟， 离心后反应管分三层，底层为微黄色的氯仿层，中间层及无色水相上层，水相上层的体积一般为提取液体积的60%。小心将上层水相转移至灭菌的离心管中，加等体积异丙醇4静置10分钟，然后4，12,000rpm离心10分钟，离心前通常看不见RNA沉淀，离心后可见胶状沉淀。去上清，加入400l 75%的乙醇洗涤RNA沉淀，混匀，4 7,000 rpm离心5分钟，小心吸去大部分乙醇。将沉淀在室温空气中干燥10分钟。(

4、注： 75% 乙醇配制时须用试剂盒中提供的DEPC H2O）。用40l DEPC H2O溶解沉淀，吸出部分溶液，测A260-A280处的吸光值，并计算RNA含量。3逆转录录反应：取灭菌00.5ml离心心管, 按以以下要求求配备逆逆转录体体系反应液I逆转录酶模板（RNNA）DEPC H22O总反应体积积6.5ll1l2g（或或5l）7.5ll20l反应条件：37水浴660分钟钟。4第一步步PCRR扩增：取灭菌00.2ml PCRR反应管管, 按以以下要求求配备PPCR体体系反应液IIITaq酶模板（cDDNA）去离子水总反应体积积6.5ll0.5ll5l13l25l反应条件：944分钟预预变性,

5、 然然后按994 30秒54 30秒72 60秒, 共做20个循循环。5第二步步PCRR扩增：取灭菌0.2mll PCRR反应管管, 按以以下要求求配备实实时定量量PCRR体系反应液Taq酶模板（PCCR产物物）去离子水总反应体积积14l1l5l30l50l注：每次实实验取1105、100、100、100一组阳阳性标准准品瞬时时离心上上机即可可反应条件：932分钟预预变性, 然然后按993 45秒秒55 60秒秒, 共做做40个循循环。6结果分分析条件件的设定定与判定定反应结束后后分析实实验数据据，仪器器自动得得出未知知标本数数值。2g RNAA标本的的PMLL/RAAR融融合基因因cDNNA含量量，最终终计算结结果按下下列公式式换算：A (拷贝数数/gg总RNNA) = BB (拷拷贝数/l cDDNA) 样本本RNAA的ODD2600值5/66。【适用仪器器】 A