地中海贫血的分子基础及产前诊断课件

1、和地中海贫血的分子基础及产前诊断 徐湘民南方医科大学，医学遗传学教研室南方医院产前诊断和遗传病诊断技术中心Zhongshan 2007, November 30地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民1和地中海贫血的分子基础及产前诊断 徐湘民Zhongsha遗传性血红蛋白病Genetic disorders of human hemoglobin 异常血红蛋白 Abnormal hemoglobin, Structural variants 地中海贫血 (地贫) Thalassemias -thalassemia -thalassemia 遗传性持续性胎儿血红蛋白 Hereditary persi

2、stence of fetal hemoglobin(HPFH)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民2遗传性血红蛋白病地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民2Thalassemia地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一中国南方不同高发地区人群携带率 1 23%研究背景地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民3Thalassemia地中海贫血是全球最大的单基因遗传病之一全球血红蛋白病人群负荷WHO地区人口(百万)出生(百万)纯合子出生(千)非洲65030.0230美洲73017.55.0亚洲315084.0120.0欧洲78011.01.6大洋洲300.50.2合计5340143.0356.8地中海贫

3、血的分子基础及产前诊断徐湘民4全球血红蛋白病人群负荷WHO地区人口出生纯合子出生(千)非洲中国南方地中海贫血人群携带率 地区携带率(%) 地贫 地贫 广东 8.53 2.54 广西 14.95 6.78 四川 1.92 2.18 台湾 4.20 1.10 香港 5.02 3.41Xu, et al. J Clin Pathol 2004, 57:517-22. Cai, et al. Chi J Epidemiol 2002,23:281-5. 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民5中国南方地中海贫血人群携带率 地区携带率(%) 地贫排序出生缺陷分析例数发生频率(/万)1先天性心脏病26019

4、.662重型地贫 20815.733多指20015.124肢体短缩111 8.395唇裂 / 腭裂109 8.24广州市主要出生缺陷的发生率 (1998-2001) 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民6排序出生缺陷分析例数发生频率1先天性心脏病26019.662Pedigree for -thalassemia in a typical family. 地中海贫血: 常染色体隐性遗传病地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民7Pedigree for -thalassemia in 地贫是严重致死、致残性遗传性血液病 常染色体隐性遗传病 受累基因： 地贫 - 珠蛋白基因（16p13.3） 地贫

5、- 珠蛋白基因（11p15.3） 突变纯合子：重型地贫 - 致死 中间型地贫 - 致残 病理学基础： /链比例失衡地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民8地贫是严重致死、致残性遗传性血液病 常染色体隐性遗传病地地贫纯合子：致死性出生缺陷重型地贫:胎儿水肿综合征 早产死胎或出生前后死亡 可导致严重产科并发症 无理想治疗方法重型地贫 出生后1年内发病 多于未成年前因严重贫血而夭折 输血和去铁治疗可维持,代价昂贵地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民9地贫纯合子：致死性出生缺陷重型地贫:胎儿水肿综合征重型地家系样品采集现场中间型地贫是严重致残性遗传病地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民10家系样品采集现

6、场中间型地贫是严重致残性遗传病地中海贫血的分子研究地中海贫血的意义 重症地贫患儿的出生是世界公认的公共卫生问题 通过产前诊断阻止重症患儿出生是首选预防措施 WHO优先推荐在发展中国家实施预防的遗传性疾病 预防地贫是中国南方高发区减少出生缺陷的战略需求研究背景地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民11研究地中海贫血的意义研究背景地中海贫血的分子基础及产前诊断徐中国需要解决的研究主题 发展用于临床和预防的分子诊断技术 高发地区人群中的遗传流行病学调查 开展人群水平的地中海贫血预防地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民12中国需要解决的研究主题地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民1指导制定计划大人群监控

7、和预防用于基因分型用于产前诊断 诊断 筛查 预防地中海贫血的研究策略研究背景遗传流行病学调查建立一系列诊断标准和诊断技术地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民13指导制定计划用于基因分型用于产前诊断 诊断 地中海贫血的临床特征小细胞低色素性溶血型贫血(中、重度)黄疸肝脾肿大 (脾大明显)骨髓扩增发育迟缓合并感染Barts 水肿胎(地贫,宫内或出生后半小时内死亡)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民14地中海贫血的临床特征小细胞低色素性溶血型贫血(中、重度)地中地中海贫血的血液学表型特征 RBC 参数 MCV MCH 细胞形态变化 Hb电泳分析 Hb A2 () 或 () Hb Barts Hb

8、H () Hb E () 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民15地中海贫血的血液学表型特征地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民16地贫血象：红细胞着色不足、异形红细胞和骨髓成红血细胞增多症地血红蛋白电泳图谱1 2 3 4 51. 正常人HB2. 轻型地贫 3. 异常HB E 杂合子4. 新生儿HB Barts (地贫标准型）5. HB HNormal AA2 AE Barts AF HA+-500V, 25min地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民17血红蛋白电泳图谱1 2 地贫发生的分子病理学经典机

9、制 地贫: 基因缺失使基因功能丢失 地贫: 结构基因变异使转录异常地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民18地贫发生的分子病理学经典机制 地贫: 基因缺失使基因功能 -50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb (-SEA) Deletion (- 4.2) Deletion (- 3.7) Deletion 2 1导致地贫的不同类型的基因缺失地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民19 -50kb -10kb Globin genes affected by thalassemia deletionSilent carrierThalassemia traitHb H diseas

10、eHydrops fetalisNormal 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民20 Globin genes affected by tha地贫疾病严重程度的单倍型顺序2 1T 2 1 2T1 1T 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民21地贫疾病严重程度的单倍型顺序地中海贫血的分子基础及产前诊断Hematological data of the proposituse and her family members. 121234512Sex/age(Y) F/49M/54M/33F/27F/25M/22F/35F/1M/5Hb(g/L) 11815017312613513 5118112

11、141RBC(1012) 5.634.965.706.234.514.575.876.095.02MCV(fL)64.585.788. 162.187.882.363.056.278.5MCH(pg) 21.030.230.420.229.929.520.118.428.1HbA(%) 97.897.593.197.096.695.796.990.097.4HbA2(%)2.202.503.272.983.373. 283.122.182. 65HbF(%)003.6200007.790Genotype-11.1/-11.1/-11.1/- 11.1/地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民22H

12、ematological data of the propJia SQ, et al. J Clin Pathol, 2004; 57:164-7. 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民23Jia SQ, et al. J Clin Pathol, Different point mutations reducing globin gene expression EXON 1IVS 1 EXON 2EXON 3 IVS 2Promoter mutationRNA splicing Initiation mutationFrameshiftNonsense Poly(A) signal Rund

13、. & Rachmilewitz. N. Engl. J. Med. 2005, 353:1135-46. 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民24Different point mutations EXON世界上不同种族的常见地贫突变类型 种 族 突变类型 地中海人 IVS-1, position 110 (G A) CD39, nonsense (CAG TAG) IVS-1, position 1 (G A) IVS-2, position 745 (C G) IVS-1, position 6 (T C) IVS-2, position 1 (G A)黑人 29, (A G); 88,

14、 (C T) Poly(A), (AATAAA AACAAA) 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民25世界上不同种族的常见地贫突变类型 种 族 东南亚人,中国人 CD 41-42, Frameshift (CTTT) IVS-2, position 654 (C T) 28, (A G); Hb E (G A) CD17, nonsense (AAG TAG) IVS-1, position 5 (G C)亚洲印地安人 IVS-1, position 5 (G C) 619-bp deletion CD 8-9, Frameshift (+G) IVS-1, position 1 (G T)

15、 CD 41-42, Frameshift (CTTT)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民26东南亚人,中国人 CD 41-42, FrameshSexProbandfemale Motherfemale Father maleBrothermale Husband maleRBC(x1012)5.7 6.4Hb (g/L) 139 105154144145MCV (fl) 73.6 68.288.273.467.1MCH (pg) 23.6 21.833.024.722.8MCHC (g/L) 357 320374336340RDW (%) 0.149 0.1520.13

16、20.1440.159HbA (%) 94.3 93.697.294.097.1HbA2 (%) 5.7 2.9Genotype -90/ N -90/NN/N-90/NN/N/ ratio 2.130 2.2193.7162.2385.341Results of blood analysis, DNA diagnosis and mRNA detection in the family members.地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民27SexProbandMotherFather BrotherSequencing of the -globin gene amplif

17、ied from the probandHeterozygosity for the CT substitution at position-90 of the-globin gene地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民28Sequencing of the -globin gen近年来发现的部分中国南方新突变基 因 突 变珠蛋白基因 11.1大片段缺失珠蛋白基因 2CD118(+TCA)珠蛋白基因 90(CT)珠蛋白基因 73(AT)珠蛋白基因 28(AC)珠蛋白基因 CDs15/16(+G)珠蛋白基因 CD38(A) 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民29近年来发现的部分中国南方新突变基

18、 因 突 变地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术 DNA诊断技术 -地贫的诊断 -地贫的诊断地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民30地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术地中海贫血的分子基础及产羊膜穿刺 (amniocentesis) 抽取胎儿样品示意图地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民31羊膜穿刺 (amniocentesis) 抽取胎儿样品示意图 植入前基因诊断 Preimplantation genetic diagnosis(PGD) 超声产前诊断 Prenatal diagnosis: Ultrasound measurement 母体外周血分离胎儿细胞进行产前诊断 Prenatal d

19、iagnosis: Fetal cells in the maternal circulation 母体血浆或血清中胎儿DNA分析 Analysis of fetal DNA in maternal plasma and serum目前及今后的胎儿产前诊断新技术地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民32 植入前基因诊断目前及今后的胎儿产前诊断新技术地中海贫血的Ding C, Chiu RW, Lau TK, Leung TN, Chan LC, Chan AY, Charoenkwan P, Ng IS, Law HY, Ma ES, Xu X, Wanapirak C, Sanguanserm

20、sri T, Liao C, Ai MA, Chui DH, Cantor CR, Lo YM. MS analysis of single-nucleotide differences in circulating nucleic acids: Application to noninvasive prenatal diagnosis.Proc Natl Acad Sci U S A. 2004 20;101(29):10762-7. 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民33Ding C, Chiu RW, Lau TK, Leung单碱基延伸产物的质谱分析M FF父亲的突变类型SABER:

21、single allele base extension reaction 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民34单碱基延伸产物的质谱分析M FF父亲的突变类型SABE分子量FMStandard protocol SABER protocol在母血浆DNA中排除父亲的地贫突变+双亲基因型不同：地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民35分子量FMStandard protocol SABER pCase CD 41/42 - CTTT IVS2 654 C T nt 28 A G CD 17A T Standard protocol SABER Fetal genotypeWeeks gesta

22、tion 1 F M N / N11 2 F M N / N18 3 F M N / N21 4 M F F / N18 5 M F F / M 17 6 F M F / N11 7 F M F / N14 8 F N / N7 9 F F / N12 10 M F N / N17 11 F F / N20 12 M & F N.A. N.A. N / N18 鉴定母血浆DNA中的父亲地贫突变地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民36Case CD 41/42IVS2 654nt 28 C单倍型分析用于鉴定母血浆DNA中的父亲等位基因Case Mother Father HBB mutant a

23、llele HBB WT allele SNP G allele Paternal HBB mutation Fetal HBB genotype3 CC GC G C N / N11 CC GC G C F / N12 CC GC G C N.A. N / N地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民37单倍型分析用于鉴定母血浆DNA中的父亲等位基因Case Mo地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术 DNA诊断技术 -地贫的诊断 -地贫的诊断地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民38地中海贫血的产前诊断 胎儿取样技术地中海贫血的分子基础及产DNA诊断技术 多重PCR （multiplex PCR） 等

24、位基因特异性性寡核苷酸杂交（ASO） 反向点杂交 （RDB） 变性高效液相色谱（DHPLC） 基于微孔板 (microtiter well-based ) 高通量检测 实时PCR (real-time PCR) 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民39DNA诊断技术 多重PCR （multiplex PCR） -50kb -10kb 0kb 10kb 20kb 30kb (-SEA) Deletion (- 4.2) Deletion (- 3.7) Deletion 2 1导致地贫的不同类型的基因缺失地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民40 -50kb -10kb Location of p

25、rimers and detection of -SEA deletion by gap-PCR地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民41Location of primers and detectGenotyping of the-SEA alleles by Gap-PCR 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民42Genotyping of the-SEA allelesChong SS, et al. Blood. 2000; 95(1):360-2. 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民43Chong SS, et al. Blood. 2000;寡核苷酸探针杂交技术地中海贫血的分子基础

26、及产前诊断徐湘民44寡核苷酸探针杂交技术地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民44ASO探针检测 -地贫基因诊断结果 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民45ASO探针检测 -地贫基因诊断结果 地中海贫血的分子基础及PCRBBBBBBgDNAHybridizationDetectionStreptavidin-PODColor Signal MMembraneASON M N M N MSubstrate(TMB)反向点杂交技术地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民46PCRBBBBBBgDNAHybridizationDeteRDB analysis: application to rapid

27、prenatal diagnosisfor eight thalassaemia mutations.GenotypeFather CDs41-42 (CTTT) / N MotherIVS-2-654 (CT) / N FetusCDs41-42 / IVS-2-654Normal control N / N 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民47RDB analysis: application to rHuman -globin gene and the PCR amplicons 5UTREXON 1IVS 1EXON 2IVS 2 IVS2EXON 33UTRFA(453bp)FB

28、(364bp)FC(423bp)-90,-73,-29,-28cd2cd13-14,cd14-15,cd15-16,cd17 cd26,cd27-28 IVS1-1,IVS1-5 cd37,cd38 cd41-42,cd43cd71-72IVS2-5,IVS2-16IVS2-654,IVS2-666地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民48Human -globin gene and the PCFragmentMutation patternsNormal patternsTotalMutationMutation + SNPHeterozygousHomozygousFA12221237FB

29、 5152224FC 0 322 7Total1740566868 uniquely profiled DHPLC patterns observed from 795 DNA samples地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民49FragmentMutation patternsNorma实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民50实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民50实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民51实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民51实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民52实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民52实验结果地中海贫血的

30、分子基础及产前诊断徐湘民53实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民53实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民54实验结果地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民54中国南方和地中海贫血的预防计划人群筛查预防计划的策略 医院水平(Hospital-based)的预防计划 社区水平(community-based)的预防计划 家系扩展筛查(screening extended families)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民55中国南方和地中海贫血的预防计划地中海贫血的分子基础及产前Carrier screening for and thalassemia in pregnancy:

31、 the results of an 11-year prospective program in Guangzhou Maternal and Neonatal Hospital Guangzhou Maternal and Neonatal Hospital Liao C Li J Huang YN Li QM Feng Q Zhong HZ Cui YYSouthern Medical University Mo QH Li LY Hua L Zhang JZ Zeng R Jia SQ Xu XMPrenat Diagn 2004, 25:163-71地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘

32、民56Carrier screening for and 地贫携带者筛查及产前诊断流程被检对象（婚前或孕中期）血液学分析（MCV，Hb A2变化）排除地贫地贫携带者遗传咨询，配偶检查血液学分析（MCV Hb A2变化）地贫携带者排除地贫遗传咨询双亲基因分析胎儿产前诊断地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民57地贫携带者筛查及产前诊断流程被检对象（婚前或孕中期）血液学分年份 筛查 广州总 筛查 孕妇数 孕妇数 丈夫数 筛查发现的 检 测 出 的 完 成 的 产 前 阳性孕妇数 阳 性 夫 妇 数 诊 断 数地贫 (%)地贫 (%)地贫 (%)地贫 (%)/地贫(%)地贫 (%)地贫 (%)1993

33、3989 68393 350 232 (5.8) 129 (3.2) 13 (3.7) 8 (2.3) 10 (2.9) 12 (92.3) 7 (87.5) 1994456471617421265 (5.8) 164 (3.6) 18 (4.3) 8 (1.9) 9 (2.1) 16 (88.9) 8 (100) 19953902 71751 361 227 (5.8) 142 (3.6) 17(4.7) 7 (1.9) 12(3.3) 15 (88.2)7 (100)19964994 74460 464 285 (5.7) 181 (3.6) 19(4.1) 8 (1.7) 12 (2.6

34、) 17 (89.5) 8 (100) 19974392 71989 401 250 (5.7) 158 (3.6) 21 (5.2) 7 (1.7) 10 (2.5)18 (85.7) 7 (100) 19984532 75378 425 263 (5.8) 172 (3.8) 17 (4.0) 8 (1.9) 12(2.8) 17 (100) 8 (100) 19995016 80141 465 285 (5.7) 186 (3.7) 24 (5.2) 8(1.7) 14(3.0) 23(95.8) 8 (100) Outcomes of screening program in GZMN

35、H 1993-2003 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民58 筛查发现的 检 测 出 的 年份 筛查 广州总 筛查 孕妇数 孕妇数 丈夫数 筛查发现的 检 测 出 的 完 成 的 产 前 阳性孕妇数 阳 性 夫 妇 数 诊 断 数地贫 (%)地贫 (%)地贫 (%)地贫 (%)/地贫(%)地贫 (%)地贫 (%)2000 4492 81817 418 256 (5.7) 172 (3.8) 21 (5.0) 7 (1.7) 16 (3.8) 21 (100) 7 (100) 2001 4521 80152 411 254 (5.6) 164 (3.6) 17 (4.1) 8 (1.9) 1

36、2 (2.9) 17 (100) 8 (100) 20024695 80667 415 260 (5.6) 163 (3.4) 16 (3.9) 8 (1.9) 11 (2.7) 16 (100) 8(100) 20034124 86393 372 227 (5.5) 152 (3.6) 15 (4.0) 6 (1.6) 13 (3.5) 15 (100) 6 (100) Total49221 860758 4503 2804 (5.7) 1783 (3.6) 198 (4.4) 83 (1.8) 131 (2.9) 187 (95.8) 82 (98.8) ( contd )地中海贫血的分子

37、基础及产前诊断徐湘民59 筛查发现的 检 测 出 的 完诊断结果 基因型 例数 正常 30 杂合子 (total) 35 CDs 41-42 (TCTT) / N 14IVS-2-654 (CT) / N 8-28 (AG) / N 5CD17 (AT) / N 3CD26 (GA) / N 2-29 (AG) / N 1 CDs27-28 (+C) / N 1 Unknown / N or Normal 1 Prenatal diagnosis in 83 fetuses at-risk for thalassemia 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民60诊断结果 基因型 例数 正常 3

38、0 杂合子诊断结果 基因型 例数 纯合子或双重杂合子(总数) 18CDs 41-42 (TCTT) / IVS-2-654 (CT) 6CDs 41-42 (TCTT) / -28 (AG) 4CDs 41-42 (TCTT) / CD17 (AT) 2IVS-2-654 (CT) / CD17 (AT) 2CDs 41-42 (TCTT) / CDs 41-42 (TCTT) 1CDs 41-42 (TCTT) / CDs 27-28 (+C) 1IVS-2-654 (CT) / CDs 71-72 (+A) 1IVS-2-654(CT) / CD43 (GT) 1总数 83( contd

39、)地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民61诊断结果 基因型 例数 纯合子或双重杂合子(总数) 18C胎儿诊断 产前诊断例数 地贫 地贫 总数 (%) 正常 41 30 69 (25.6) 携带者 92 35 125 (46.3) 受累胎儿 *54 18 72 (26.7) 胎儿流产 2 1 3 (1.11) 误诊 0 0 0.0 总数(%) 187 (69.3) 83 (30.7) 270 (100) Results in 266 pregnancies where a precisediagnosis was achieved * Three Hb H disease involved地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民62胎儿诊断 产前诊断例数 Detection of the -SEA/ deletion by 1% agarose gelelectrophoresis of amplified fragments using gap-PCR. M N P B Fa Mo Fe Fa Mo Fe Fa Mo Fe Normal Heterozygote HomozygoteFamily 1 Family 2 Family3NormalMutant 地中海贫血的分子基础及产前诊断徐湘民63Detection of th