分子生物学在检验医学中的应用课件

1、分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用一、分子生物学在检验医学中的常用技术1、 PCR技术2、 RT-PCR技术3、 RFLP4、 SSCP5、 MSP6、 测序分子生物学在检验医学中的应用一、分子生物学在检验医学中的常用技术分子生物学在检验医 二、外源性疾病的检验与诊断：1、 细菌、支原体、衣原体、寄生虫、 病毒等2、 SARS冠状病毒的分子生物学检测分子生物学在检验医学中的应用 二、外源性疾病的检验与诊断：分子生物学在检验医学中的分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用分子

2、生物学在检验医学中的应用BNIoutS/BNoutAs: sense ATGAAT TAC CAA GTC AAT GGT TAC antisense CAT AAC CAG TCG GTA CAG CTA C FraGment lenGth 195 bp BNIinS/BNIAs: sense GAA GCT ATT CGT CAC GTT CG antisense CTGTAGAAA ATC CTA GCT GGA G Fragment length 110 bpSAR1s/SAR1as: sense CCT CTC TTG TTC TTG CTC GCA antisense TAT AG

3、T GAG CCG CCA CAC ATG Fragment length 150 bp分子生物学在检验医学中的应用BNIoutS/BNoutAs: 分子生物学在检验医学中的应Amplicon sequence (BNI-1, Bernhard-Nocht Institute, Hamburg, Germany) TACCGTAGACTCATCTCTATGATGGGTTTCAAAATGAATTACCAAGTCAATGGTTACCCTAATATGTTTATCACCCGCGAAGAAGCTATTCGTCACGTTCGTGCGTGGATTGGCTTTGATGTAGAGGGCTGTCATGCAACTA

4、GAGATGCTGTGGGTACTAACCTACCTCTCCAGCTAGGATTTTCTACAGGTGTTAACTTAGTAGCTGTACCGACTGGTTATGTTGACACTGAAAATAACACAGAATTCACCAGAGTTAATGCAAAACCTCCACCAGGTGACCAGTTTAAACATCTTATACC分子生物学在检验医学中的应用Amplicon sequence (BNI-1, BernSARS-specific primers: Cor-p-F2 (+) 5CTAACATGCTTAGGATAATGG 3, Cor-p-F3 (+) 5GCCTCTCTTGTTCTTGCTCG

5、C 3, Cor-p-R1 (-) 5CAGGTAAGCGTAAAACTCATC 3, Product size: Cor-p-F2/Cor-p-R1 :368 bp Cor-p-F3/Cor-p-R1 :348 bp分子生物学在检验医学中的应用SARS-specific primers: Cor-p-Government Virus Unit 9/F Public Health Laboratory Centre 382 NAm Cheong Street Shek Kip Mei Kowloon, Hong Kong SAR Hong Kong - SAR China COR-1,COR-

6、2: sense 5 CAC CGT TTC TAC AGG TTA GCT AAC GA 3 antisense 5 AAA TGT TTA CGC AGG TAA GCG TAA AA 3 Product size: 310 bp分子生物学在检验医学中的应用Government Virus Unit 9/F PubQueen Mary Hospital The University of Hong Kong University Pathology Building Hong Kong - SAR ChinaHKU: sense 5 TACACACCTCAGCGTTG 3 antisens

7、e 5 CACGAACGTGACGAAT 3 Product size 182 bps分子生物学在检验医学中的应用Queen Mary Hospital The Unive 二、内源性疾病的检验与诊断：1、 临床基因变异酶的分子性质研究 1） 用PCR-SSCP技术发现我国第一例 LDH遗传变异病例分子生物学在检验医学中的应用 二、内源性疾病的检验与诊断：分子生物学在检验医学中的应 病 例 21岁男性： LDH：75 U/L (参考范围：110-240 U/L)其余指标均正常在三年的调查期间，LDH活力始终处于较低水平，在 48-85 U/L之间分子生物学在检验医学中的应用 病 例分子 经排除

8、其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的影响等可能因素外，我们怀疑可能有遗传性的LDH变异。根据计算红细胞中H、M亚基的比值，初步断定为H亚基变异，采用合成的7对引物，分别扩增LDH基因中的7个外显子，然后用SSCP电泳法与正常人对照，发现变异发生在外显子4上，由此证明该病人的长期低酶活力是有基因变异引起的。分子生物学在检验医学中的应用 经排除其它原因，如血中的抑制剂的存在、药物的 2n 2 3n 3 4n 4 5n 5 6n 6 分子生物学在检验医学中的应用 2n 2）LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及 对检验结果的影响 基因变异可导致酶分子组成结构发生变化，对酶活力和酶的物理化学性质造成影

9、响，可给临床医生造成诊断陷阱(pitfall)，因为在不同疾病状态下，从相关联的组织器官中释放出的酶与预期的不同，病人血清酶活力不能完全反映各种疾病的状态，容易造成误诊。 分子生物学在检验医学中的应用2）LDH-A和LDH-B亚基遗传变异及 对检 LDH-A基因变异类型_变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响A-171 CGA-TGA Arg-Ter 无义突变A-328 GAG-TAG Glu-Ter 无义突变A-81 GAC-AAC Asp-Asn 外显子2丢失A-220 AAA-GAA Lys-Glu 电荷变化A-314 CGT-TGT Arg-Cys 电荷变化A-20 插入C 移码突变A-

10、128 TGTTGT-TGT ValVal-Val 辅酶结合A-213 丢失2 bp (CT) 移码突变A-251 丢失20 bp 移码突变分子生物学在检验医学中的应用 LDH-A基因变异类型分 LDH-B基因变异类型变异位置 DNA 氨基酸置换 影 响B-6 AAA-GAA Lys-Gly 电荷变化B-35 GCC-GAG Ala-Glu 辅酶结合B-103 8bp重复 移码突变B-131 AGT-CGT Ser-Arg 辅酶结合B-139 丢失2 bp (TC) 移码突变B-145 4bp重复 移码突变B-147 TAT-TAG Tyr-Ter 无义突变B-171 CGC-CCC Arg-

11、Pro 基质结合B-172 TTT-GTT Phe-Val 基质结合B-173 CGC-CAC Arg-His P轴的安定性B-176 ATG-TTG Met-Leu 分子稳定性B-287 丢失1bp(C) 移码突变B-320 GAT-GTT Asp-Val 电荷变化 分子生物学在检验医学中的应用 LDH-B基因变异类型 3) CK变异的分子性质及对酶活力 的影响病例56岁妇女，胸痛一天后被送入急诊科 心电图和临床症状提示AMI实验室检查： LDH 6900 U/L (200-400 U/L) LDH-1/LDH-2 1.72 CK 37 U/L (15-130 U/L) CK-MB 0 U/

12、L 分子生物学在检验医学中的应用 3) CK变异的分子性质及对酶活力 的影响病例分子生 RT-PCR结果 分子生物学在检验医学中的应用 RT-PCR结果 分子生分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用外显子2 残基54处 A G GAC GGC 天冬氨酸 甘氨酸 位于酶结构的第4个-螺旋分子生物学在检验医学中的应用外显子2 残基54处分子生物学在检验医学中的应用 4）变异酶人群的检验结果不同于常 规人群的检验结果 结合临床研究发现变异酶的检验结果与常人存在着显著的差异，即这类人群发病前酶活力常低于正常人的参考范围，发病时则上升至正常人的参考范围之内，这个现象可能给临床医生正确诊

13、断造成困难；分子生物学在检验医学中的应用 4）变异酶人群的检验结果不同于常 规1） 2、 2、电泳异常带的分子性质研究分子生物学在检验医学中的应用1） 分子生物学在检验医学中的应用 1） LDH异常电泳酶谱 M4 H1M3 H2M2 H3M1 H4 (+)LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1 正常 H 缺失 M 缺失 H 变异 (slow) H 变异 (fast)分子生物学在检验医学中的应用 1） LDH异常电泳酶谱 M4 H1M H 发生变异时，产生H 和h M4 H1M3 H2M2 H3M1 H4 LD-5 LD-4 LD-3 LD-2 LD-1 H1M3 h1M3 H2M2

14、H4 h2M2 h1 H3 hHM2 h2 H2 h3 H1 h4 分子生物学在检验医学中的应用 H 发生变异时，产生H 和h 分子生物学在检分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用2） 异常电泳酶谱的分子性质 1）核苷酸的变异引起氨基酸的改变， 2）变异后的氨基酸的酸碱性与变异前的氨基酸的酸碱性不同， 3）变异的氨基酸位于分子的表面。 结果：产生异常的电泳结果分子生物学在检验医学中的应用2） 异常电泳酶谱的分子性质 1）核苷酸的变3） 异常谱形的分析方法分子生物学在检验医学中的应用3） 异常谱形的分析方法分子生物学在检验

15、医学中的应LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图血清（浆）同工酶分析（异常形式）红细胞、白细胞同工酶分析正常谱型 异常谱型 免疫对流、固定、混合法鉴定 遗传变异（H或M亚基变异） （+） （-） LDH-Ig复合物 肿瘤产生LDH 基因分析 分子生物学在检验医学中的应用LDH遗传变异和非遗传变异的分析流程图分子生物学在检验医学中LDH H/M 比值的计算- LDH-1 LDH-2 LDH-3 LDH-4 LDH-5H亚基数 4 3 2 1 0M亚基数 0 1 2 3 4 % A B C D E-计算方法： H = A+ 3/4 B + 2/4 C + D M = 100 - H H/M = H

16、 / ( 100 H )分子生物学在检验医学中的应用LDH H/M 比值的计算- 2、 后生性调控标志物分子生物学在检验医学中的应用 2、 后生性调控标志物分子生物学在检验医学中的应用1、DNA甲基化-后生性调控的主要方式 DNA甲基化是不改变基因序列，而是通过在DNA的CG二核苷酸胞嘧啶的第5位碳原子上加上甲基，从而调节基因的表达。分子生物学在检验医学中的应用1、DNA甲基化-后生性调控的主要方式 分子生物学在检验医分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用 2） 启动子甲基化作为新的分子诊断 标志物的研究分子生物学在检验医学中的应用 2） 启动子甲基化作为新的分子诊断 分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用 3） 启动子甲基化在分析LDH异常带 分子性质中的首例应用病例 4岁儿童 遗传性Rb 转移到颈淋巴结 血清LDH 升高 异常同工酶带LD2ex 位于 LD1和LD2之间分子生物学在检验医学中的应用 3） 启动子甲基化在分析LDH异常带 分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用分子生物学在检验医学中的应用分