广西地方标准《水稻品种抗水稻齿叶矮缩病人工接种鉴定技术规范》征

1、Q/LB.XXXXX-XXXX前言本文件按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定起草。本文件由广西壮族自治区农业科学院提出并宣贯。本文件由广西农业种植业标准化技术委员会归口。本文件起草单位：广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所。本文件主要起草人：秦碧霞、谢慧婷、崔丽贤、李战彪、蔡健和、陈锦清。水稻品种抗水稻齿叶矮缩病人工接种鉴定技术规范范围本文件规定了水稻品种抗水稻齿叶矮缩病（病原：水稻齿叶矮缩病毒，Rice ragged stunt virus，RRSV）人工接种鉴定评价标准及技术规范。本文件适用于水稻品种抗齿叶矮缩病鉴定评价和水稻种质抗齿叶矮

2、缩病资源的筛选。规范性引用文件本文件没有规范性引用文件。术语和定义下列术语和定义适用于本文件。水稻齿叶矮缩病 Rice ragged stunt disease由水稻齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）侵染引起的水稻病毒病。病株 diseased plants 感染水稻齿叶矮缩病毒并表现相应症状的水稻植株（病害鉴定调查标准见4.4.2）。发病率 the rate of diseased plants病株占调查水稻总植株数的百分率。无毒褐飞虱 non-viruliferous brown planthopper不携带水稻齿叶矮缩病毒的褐飞虱 (Nilaparv

3、ata lugens(Stl)。人工接种鉴定接种用褐飞虱的准备褐飞虱的采集和饲养褐飞虱若虫或成虫采集自田间。在养虫室内用感虫水稻品种TN1（台中本地1号）连续饲养。养虫室条件为：温度（281） , 相对湿度8090，光照周期L:D=12 h:12 h。无毒褐飞虱群体的获得选取褐飞虱喜食的水稻品种（如TN1）的种子用清水常温浸种24 h后，清洗干净用湿布覆盖，置恒温箱（322） 催芽24 h48 h，选取出芽整齐一致的种子25粒30粒均匀撒播于盛有自然肥力土壤的无孔塑料花盆（上口径20 cm，高14 cm，下同）中，放在60目防虫笼（下同）内育苗，常规管理；（405）d后水稻进入分蘖期，将怀卵的

4、褐飞虱单头移入防虫笼中水稻苗上产卵，3 d后取出成虫，立即进行带毒率检测或置于小型容器中-20 保存待检。稻苗继续培养7 d10 d，孵化出褐飞虱后代若虫群体，每群体取10头20头2龄或3龄若虫进行带毒性检测。褐飞虱带毒性检测参见附录A进行，产卵成虫及其后代若虫均不带毒的群体定义为无毒褐飞虱群体。毒源准备病株采集采集田间表现水稻齿叶矮缩病疑似症状的水稻植株，移栽在无孔塑料花盆中，并置于防虫笼内。病株检测确定采疑似病株叶片，参见附录A进行水稻齿叶矮缩病毒检测，确认带毒则将对应的病株作为毒源保存在防虫笼中。病株纯化扩繁在防虫笼中，不带毒褐飞虱在4.2.2病株上饲毒2d后接种健康水稻秧苗（TN1），

5、纯化并扩繁病株。接种鉴定参鉴水稻苗的准备 参鉴品种（含感病对照TN1）经4.1.2方法浸种、催芽；选取30粒发芽整齐一致的种子，分别点播于盛有自然肥力土壤的塑料杯(内径8 cm11 cm,下同)中，每品种重复3次。褐飞虱饲毒将经检测确定感染RRSV的4.2.3病株移栽于大烧杯(内径10 cm20 cm)中, 土面覆盖滤纸, 将适量1龄2龄无毒褐飞虱移入烧杯中的水稻苗上饲毒, 并用60目防虫网覆盖杯口。2 d后将已饲毒褐飞虱移入防虫笼内无孔塑料花盆的水稻苗（TN1）上饲养，度过循回期（8d11d）后，每批随机取出50头褐飞虱高龄若虫或成虫，参见附录A检测单头褐飞虱带毒情况，计算褐飞虱群体带毒率。

6、接种方法根据4.3.2测定的褐飞虱带毒率，计算接虫数量后接入已育有参鉴品种的塑料杯中，接种苗龄为1.5叶2.5叶龄期，接种时间为2 d，接种温度（281） ，每天上午和下午各赶虫一次，使褐飞虱分布均匀，2 d后用杀虫剂喷杀褐飞虱，把秧苗移栽到防虫网室水田池中，20 35 下常规管理，定期观察植株发病情况。人工接种鉴定的有效接种虫量用IVS表示，数值以头/苗计，按公式(1)计算：IVS=N*PVS(式中：IVS人工接种鉴定的有效接种虫量；N接种褐飞虱数量；PVS褐飞虱带毒率。当IVS值处于1头2头/株范围内，则试验有效。调查调查时间接种（255）d后，待感病对照症状明显时开始调查发病情况，同时确

7、定有效鉴定株数，间隔7 d调查一次，共调查3次。调查标准苗期发病症状：植株浓绿矮缩，分蘖增多，新叶叶尖扭曲呈螺旋状，部分叶片叶缘出现锯齿状缺刻，或叶鞘和叶片基部出现长短不一的线状脉肿；植株矮缩，叶色稍浓绿。病株判定出现4.4.2.1中a)症状的植物直接记为病株；出现4.4.2.1中b)症状的植株，参见附录A检测确认。发病率计算根据感病对照3次调查的最高发病率确定待鉴品种发病率的计算方式，感病对照3个重复三次调查中的最高发病率均超过30，则认定本次鉴定有效；若参鉴品种3个重复三次调查中的最高抗性级别差异均不超过1个等级，则认定本次鉴定准确。在鉴定有效且准确的前提下，取3个重复三次调查中的最高发病

8、率确定品种的抗性级别。如果感病对照的最高发病率小于30，则认定本次鉴定结果无效。发病率用Ri表示，数值以计，按公式(2)计算：Ri=nint式中：Ri发病率；ni病株数；nt总株数。计算结果精确到小数点后两位。抗病性评价抗性分级标准抗性分级标准如下：0级：发病率为0，免疫；1级：发病率为0.015.00，抗病；3级：发病率为5.0115.00，中抗；5级：发病率为15.0130.00，中感；7级：发病率为30.0150.00，感病；9级：发病率大于50.00，高感。抗性评价当品种抗性在不同地区间、不同年度间或批次间鉴定结果表现不一致时，抗性结果为其中的最差等级。（资料性）水稻齿叶矮缩病毒RT-

9、PCR检测方法试剂除特别说明以外，本标准所用试剂均为分析纯，所有试剂均用无RNA酶污染的容器配置。液氮：保存于液氮罐或保温桶中。RNAiso PLUS (购自宝生物工程（大连）有限公司)。氯仿。异丙醇：-20 预冷。DEPC水：用0.1%DEPC（焦碳酸乙二酯）处理后的去离子水。75乙醇（DEPC水配制）。琼脂糖。Tris 碱。冰乙酸。EDTA（0.5 mol/L）。50TAE配方：Tris碱242 g，冰乙酸57.1 mL，EDTA（0.5 mol/L）100 mL，定容至1 000 mL。PrimeScriptTM One Step RT-PCR Kit一步反转录试剂盒(购自宝生物工程（大

10、连）有限公司)。DNA Marker (购自宝生物工程（大连）有限公司)。Gel-red染色工作液(购自Invitrogen公司) 。仪器设备仪器设备包括：称量天平：精度等级为0.01 g；台式高速冷冻离心机（离心速度12 000 r/min以上）；冰箱（2 8 和-20 ）；微量可调移液器（10 L、100 L、1 000 L）及配套吸头；离心管（1.5 mL、2.0 mL，RNAase-free）；研砵。检测引物正向引物 RRSV-F 5-GCC TTT CGT GCA ATT CCC-3。 反向引物 RRSV-R 5-GCG TCA TCA CCA AAG TTA GCC-3。操作步骤采

11、样工具下列采样工具应经（1212） ，高压灭菌15 min并烘干。剪刀，镊子，研钵，Eppendorf管（1.5 mL、2.0 mL）。样品采集单头褐飞虱放入1.5 mL离心管中，新鲜水稻叶片或茎秆组织，放入密闭的自封袋内，贴好标签，并尽快运回实验室进行检测或-20 保存待检，存放不能超过7 d。样品保存新鲜样品若需长期保存应置于-70 以下，避免反复冻融。总RNA提取步骤如下：单头褐飞虱直接在1.5 mL离心管中加入少量液氮用烧钝的枪头研磨，水稻组织取0.1 g放入研钵中，倒入适量液氮，以研磨棒将样本磨碎至粉末状，迅速转移至1.5 mL离心管中；加入1 mL RNAiso plus，充分混匀

12、； 加入0.2 mL氯仿，盖好管盖，充分混匀至溶液呈乳白色，室温静置5 min；12 000 r/ min，4 离心15 min；吸取c)各管中的上清液转移至1.5 mL离心管中，不应吸到中间层，向管中加入等体积预冷异丙醇，颠倒混匀，室温静置10 min；12 000 r/min，4 离心10 min，弃上清，加入600 L75乙醇，上下颠倒洗涤；12 000 r/min，4 离心5 min，弃上清；4 000 r/min 离心10 s，小心弃上清，室温干燥3 min5 min；加入10 L15 L DEPC水，轻轻混匀，冰上保存备用。若需长期保存应放置-70 冰箱。RT-PCR检测扩增试剂准

13、备在反应混合物配制区进行。从试剂盒中取出相应的RT-PCR反应液，设所需RT-PCR检测总数为n，其中n为被检样品、阳性对照 、阴性对照、空白对照的数量和，每个样品测试反应体系配制见表A.1。每个样品测试反应体系试剂使用量终浓度PrimeScript 1 Step Enzyme Mix2 L21 Step Buffer（Dye Plus）25 L正向引物RRSV-F1 L0.4 M反向引物RRSV-R1 L0.4 MTemplate RNA1 L3 LRNase Free dH2O补充反应体积至50 L循环条件设置将A.4.5.1.2中配制好反应液的PCR管做标记后放入PCR仪内，记录样本摆放

14、顺序。 循环条件设置：第一阶段：50 反转录30 min；第二阶段：94 预热2 min；第三阶段：94 预变性30 s，58 退火30 s，72 延伸1 min，30个循环；第四阶段：72 延伸5 min。PCR反应产物进行电泳检测或4 条件下保存备用。电泳检测分别取PCR反应液5 L加入预先混有Gel-red工作液的1%琼脂糖凝胶孔中（1TAE缓冲液），电泳20 min30 min（120 V）。结果判定电泳结束后，将琼脂糖凝胶置于凝胶成像仪上观察，根据DNA Marker标记判断扩增的条带大小，如果阳性对照和检测样品同时出现894 bp的目的扩增条带，而阴性对照、空白对照均不出现该条带，

15、该样品判断为携带水稻齿叶矮缩病毒；如果阳性对照出现目的扩增条带894 bp，而阴性对照、空白对照及检测样品均不出现该条带，该样品判断为不携带水稻齿叶矮缩病毒。广西壮族自治区地方标准水稻品种抗水稻齿叶矮缩病人工接种鉴定技术规范(征求意见稿)编制说明2022年04月一、任务来源和起草单位“水稻品种抗水稻齿叶矮缩病人工接种鉴定技术规范”于2017年5月被列入广西壮族自治区质量技术监督局2017年第四批广西地方标准制定（修订）项目计划，项目编号为2017-0458。 本文件由广西壮族自治区农业科学院提出，广西壮族自治区农业科学院植物保护研究所负责起草编写。按推荐性广西地方标准制定。二、目的意义水稻齿叶

16、矮缩病毒病由水稻齿叶矮缩病毒（Rice ragged stunt virus，RRSV）侵染引起，是迁飞性害虫褐飞虱传播的病害，近年来在广西、广东、福建、海南、云南及越南等东盟国家发生严重，发病田块一般减产10% 20%, 严重的减产80%100%，且经常与南方水稻黑条矮缩病复合感染，对水稻生产和粮食安全构成严重威胁。推广种植抗(耐)病品种是经济有效的防治措施之一，但目前缺乏统一的抗病性鉴定技术操作规程，水稻品种对该病害的抗病性缺乏有效评价。研究制定水稻品种抗齿叶矮缩病人工接种鉴定技术规范，有利于开展水稻品种抗病性鉴定工作，为进一步挖掘抗病基因、抗病育种和病害综合防控奠定基础。对贯彻以利用抗病

17、品种为基本手段的水稻齿叶矮缩病综合防治策略，保障我国水稻高产和优质、实现粮食安全生产和农业可持续发展具有重要意义。三、国内外标准对比情况据查阅，目前国内还没有关于水稻齿叶矮缩病人工接种鉴定技术国家标准和行业标准的编制，该广西地方标准水稻品种抗水稻齿叶矮缩病人工接种鉴定技术规范的编写对水稻品种抗病性鉴定的规范操作有重要的指导作用。四、编制过程1、组成编制小组，制订工作计划项目下达后，成立了编制工作小组，制定编写计划，并进行人员分工（表1）。表1 主要编制人员与责任分工秦碧霞女研究员植物病理学广西农业科学院植物保护研究所主持, 重要指标确定，编写规程谢慧婷女副研究员植物病理学广西农业科学院植物保护

18、研究所数据收集、编写崔丽贤女农艺师农学广西农业科学院植物保护研究所技术指标验证李战彪男副研究员植物病理学广西农业科学院植物保护研究所资料收集蔡健和男研究员植物病理学广西农业科学院植物保护研究所数据收集陈锦清女无植物病理学广西农业科学院植物保护研究所检测、指标验证2、收集整理资料收集整理国内、区内已颁布的相关标准、国内公开发表的相关技术性资料。整理总结编制团队成员相关试验研究成果。3、确定编写原则根据水稻齿叶矮缩病的发生危害特点，结合本所主持及参加的国家重点研发计划项目、广西科学研究与技术开发计划项目、国家现代农业产业技术体系广西创新团队建设专项（水稻）、广西农科院基本科研业务专项等与水稻矮缩病

19、相关的研究内容及试验数据为制定依据，本着品种抗性鉴定“简便、实用、准确、规范”的要求，就水稻品种抗水稻齿叶矮缩病鉴定方法进行了规范。4、编写修改，形成征求意见稿参照广西地方标准编制的基本格式，按照GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定，起草了该标准的征求意见稿，并通讯征求区内外9位有关标准研究、推广、使用等不同领域、不同类型单位专家的意见，修改形成征求意见稿。五、标准关键技术指标依据和来源 本标准为推荐性广西地方标准。依据GB/T 1.12020标准化工作导则 第1部分：标准化文件的结构和起草规则的规定编制，参考NY/T 2955-2016水稻品种试

20、验 水稻黑条矮缩病抗性鉴定与评价技术规程等相关标准，并根据编制小组前期研究成果、参考国内文献资料并经反复试验验证，确定了褐飞虱的饲毒时间、循回期、传毒时间和接种苗龄等关键技术指标，并对广西45个主栽水稻品种进行抗齿叶矮缩病鉴定评价，验证了人工接种方法的可行性，已发表论文1篇（谢慧婷等，2017），获授权发明专利1件（ZL 2021 1 1072966.2），授权实用新型专利2件（ZL 2021 2 2741492.8，ZL 2021 2 2744411.X），已受理实用新型专利1件（202220293686.8）。褐飞虱饲毒时间的确定金登迪等（1987）研究结果表明，褐飞風1龄2龄若虫饲毒48

21、h获毒率高达62.3%，雷娟利等（1999）用1龄2龄若虫饲毒48h获毒率58.6%，成功用于测定转基因水稻对齿叶矮缩病的抗性评价。谢慧婷等（2017）用低龄褐飞虱若虫饲毒2d3d，带毒率达63.6%100%，成功用于广西主栽水稻品种抗病性测定。试验用1龄2龄褐飞虱无毒若虫，分别在病株上取食12、24、48、72h后转移至健康水稻苗度过循回期，用于接种2叶期TN1水稻苗，接种后将水稻苗移栽至防虫网室观察，正常水肥管理，25d后开始调查发病率，每7d调查一次，连续调查3次，统计每个处理的发病率。发病情况见表2，综合参考文献、试验结果、接种的可操作性及效率，确定褐飞虱饲毒时间为48h（2d）。表2

22、 褐飞虱不同饲毒时间接种水稻品种TN1的发病率饲毒时间总株数病株发病率（%）12h281346.4324h261453.0548h302066.6772h282589.29病毒循回期时间确定 金登迪等（1987）研究结果表明，褐飞虱体内病毒循回期最短5天，最长18天，平均8.3天，其中5天8天的占81.8%。谢慧婷等（2017）参照金登迪等研究结果对主栽水稻品种进行抗齿叶矮缩病鉴定，明确了主栽水稻品种对齿叶矮缩病的抗性，取得满意结果。试验取1龄2龄无毒若虫在病株上饲毒2d，之后转移至健康水稻苗上饲养，第6、7、8、9、10d分别用于接种2叶期TN1水稻苗，接种后将水稻苗移栽至防虫网室观察，正常

23、水肥管理，25d后开始调查发病率，每7d调查一次，连续调查3次，统计每个处理的发病率。发病情况见表3，循回期8d、9d和10d发病率分别为74.07%、82.76%和96.43%，综合参考文献、试验结果、接种的可操作性及效率，确定病毒循回期为8d11d。表3不同循回期褐飞虱接种水稻品种TN1的发病率循回期时间总株数病株发病率（%）6d301446.677d281864.298d272074.079d292482.7610d282796.433、褐飞虱传毒时间的确定金登迪等（1987）研究结果表明，褐飞風传毒时间最短为0.5h，传毒率为2.6%，传毒率随传毒时间延长有所递增，24h的传毒率达40

24、.4%。雷娟利等（1999）、谢慧婷等（2017）用饲毒48h的带毒褐飞虱接种48h的方法分别完成了转基因水稻和主栽水稻品种对齿叶矮缩病的抗性评价。取已饲毒且度过循回期的褐飞虱，接种2叶期TN1水稻苗，传毒时长设12、24、48和72h 4个时间段，到设定时间后移出白背飞虱，将水稻苗移栽至防虫网室观察，正常水肥管理，25d后开始调查发病率，每7d调查一次，连续调查3次，统计每个处理的发病率。发病情况见表4，传毒48h和72h，发病率分别为90%和100%，综合参考文献和试验结果，确定褐飞虱传毒时间为48h。表4褐飞虱不同传毒时间接种水稻品种TN1的发病率传毒时间总株数病株发病率（%）12h28

25、1242.8624h281864.2948h302790.0072h26261004、水稻接种苗龄确定谢慧婷等（2017）对主栽品种1.5叶2.5叶龄期进行苗期抗病性鉴定，明确了主栽品种的抗病性，结果符合预期。试验设1、2、3叶期（品种：TN1）共3个处理，按有效接种虫量2头/苗接入度过循回期的褐飞虱，接种2d后移栽至防虫网室观察，正常水肥管理，25d后开始调查发病率，每7d调查一次，连续调查3次，统计每个处理的发病率。发病情况见表4，结果表明，1叶期至3叶期苗龄水稻发病率为96.42%100.00%，综合考虑接种便捷性和接种工作效率，接种水稻苗龄确定为1.5叶-2.5叶龄期。表5 褐飞虱接种

26、不同生育期水稻品种TN1的发病率生育期总株数病株发病率（%）1叶期2828100.002叶期 3030100.003叶期282796.425、有效接种虫量的确定雷娟利对转基因水稻进行水稻齿叶矮缩病抗性评价，用带毒虫进行攻毒接种，每苗2虫，接种2d，获得几个抗性较好的水稻转基因系；谢慧婷等对广西水稻主栽品种进行抗病性测定，按平均每苗有效接种虫量1头-1.5头，接种2d，明确了主栽品种的抗病性，结果符合预期。有效接种虫量=接种虫量带毒率，设有效接虫量0.5、1、1.5、2、2.5、3头/株6个处理，重复3次。于TN1水稻苗2.5叶龄期，接入度过循回期的带毒褐飞虱成虫， 2d后移走褐飞虱，将水稻苗移

27、栽至防虫网室观察，正常水肥管理。25d后开始调查发病率，每7d调查一次，连续调查3次，统计每个处理的发病率。发病情况见表6。随着有效接种虫量的增加，TN1的发病率有所提高，当有效接种虫量为1头/株2头/株时，TN1的发病率为82.76%96.43%，达到预期发病率，综合考虑介体的使用效率和抗病接种实际需要，有效接种虫量确定为1头/株2头/株。表6 不同有效接种虫量下水稻品种TN1的发病率有效接种虫量（头/株）总株数病株发病率（%）0.5301860.001292482.761.5302790.002282796.432.5302996.6732626100.006、抗性评价标准确定抗性评价标准

28、参考农业行业标准水稻品种试验 水稻黑条矮缩病抗性鉴定与评价技术规程（NY/T 2955-2016）。六、自我承诺 编制的地方标准技术指标不低于强制性国家标准的相关技术要求，与有关的推荐性国家标准、行业标准不相冲突。七、贯彻标准的措施与建议建议由广西质量技术监督局会同有关部门组织该标准的贯彻实施。地方政府相关职能部门与研究单位应强化对抗水稻齿叶矮缩病水稻品种的审定、推广的行政管理与技术指导。参考文献丁新伦，谢荔岩，潘贤，吴祖建*. .水稻齿叶矮缩病毒Pns10 蛋白的原核表达、抗血清制备及初步应用J. 激光生物学报，2012，21（6）：546-550.江建云，柳桂秋，吴美伍，雷惠质.褐飞虱的群体饲养方法J.应用昆虫学报，1987. 48( 5) : 1314-1320.金登迪，林瑞芬，余舰斌. 水稻齿叶矮缩病的潜育期及介体褐稻虱的传毒特性J. 浙江农业科学，1987，（5）：236-237.雷娟利，吕永平，金登迪，陈剑平，陈声祥*转基因水稻对水稻齿叶矮缩病毒（RRSV）抗性评价J. 浙江农业学报，1999，11（5）:217-222雷娟利，吕永平，金登迪，陈声祥，陈剑平*.应用RT-PCR