毕业论文-马铃薯StUBC30基因的克隆及表达载体的构建

1、PAGE PAGE 16 本科毕业论文题 目 马铃薯StUBC30基因的克隆 及表达载体的构建 学 院 生命科学技术学院 专 业 生物技术（植物方向） 毕业届别 2 姓 名 指导教师 职 称 甘肃农业大学教务处制 二一八年五月目 录 TOC o 1-3 h z u HYPERLINK l _Toc515791535 摘要 PAGEREF _Toc515791535 h 2 HYPERLINK l _Toc515791536 关键词 PAGEREF _Toc515791536 h 2 HYPERLINK l _Toc515791537 Abstract PAGEREF _Toc515791537

2、 h 2 HYPERLINK l _Toc515791538 Key words PAGEREF _Toc515791538 h 2 HYPERLINK l _Toc515791539 前言 PAGEREF _Toc515791539 h 3 HYPERLINK l _Toc515791540 1材料与方法 PAGEREF _Toc515791540 h 4 HYPERLINK l _Toc515791541 1.1 材料与试剂 PAGEREF _Toc515791541 h 4 HYPERLINK l _Toc515791542 1.1.1 材料 PAGEREF _Toc515791542

3、h 4 HYPERLINK l _Toc515791543 1.1.2 仪器与试剂 PAGEREF _Toc515791543 h 4 HYPERLINK l _Toc515791544 1.2 方法 PAGEREF _Toc515791544 h 5 HYPERLINK l _Toc515791545 1.2.1 StUBC30基因引物的查询与设计 PAGEREF _Toc515791545 h 5 HYPERLINK l _Toc515791546 1.2.2马铃薯试管苗的培养 PAGEREF _Toc515791546 h 5 HYPERLINK l _Toc515791547 1.2.

4、3马铃薯RNA的提取与cDNA链的合成 PAGEREF _Toc515791547 h 5 HYPERLINK l _Toc515791548 1.2.4马铃薯StUBC30基因的PCR扩增 PAGEREF _Toc515791548 h 5 HYPERLINK l _Toc515791549 1.2.5 PCR产物的回收 PAGEREF _Toc515791549 h 6 HYPERLINK l _Toc515791550 1.2.6 T18载体连接 PAGEREF _Toc515791550 h 6 HYPERLINK l _Toc515791551 1.2.7连接产物的转化 PAGERE

5、F _Toc515791551 h 6 HYPERLINK l _Toc515791552 1.2.8阳性克隆的测序与序列分析 PAGEREF _Toc515791552 h 7 HYPERLINK l _Toc515791553 1.2.9表达载体的构建 PAGEREF _Toc515791553 h 7 HYPERLINK l _Toc515791554 1.2.10连接产物的检测 PAGEREF _Toc515791554 h 8 HYPERLINK l _Toc515791555 2 结果与分析 PAGEREF _Toc515791555 h 8 HYPERLINK l _Toc515

6、791556 2.1 RNA纯度的测定结果8 HYPERLINK l _Toc515791557 2.2 RNA的凝胶电泳结果 PAGEREF _Toc515791557 h 9 HYPERLINK l _Toc515791558 2.3目的基因凝胶电泳结果 PAGEREF _Toc515791558 h 9 HYPERLINK l _Toc515791559 2.4克隆载体构建及其送测结果 PAGEREF _Toc515791559 h 10 HYPERLINK l _Toc515791560 2.5双酶切结果 PAGEREF _Toc515791560 h 11 HYPERLINK l _

7、Toc515791561 2.6目的片段与表达载体连接结果 PAGEREF _Toc515791561 h 11 HYPERLINK l _Toc515791562 3 讨论 PAGEREF _Toc515791562 h 12 HYPERLINK l _Toc515791563 参考文献 PAGEREF _Toc515791563 h 13 HYPERLINK l _Toc515791564 致谢 PAGEREF _Toc515791564 h 14 HYPERLINK l _Toc515791565 附录1 PAGEREF _Toc515791565 h 15 HYPERLINK l _T

8、oc515791566 附录2 PAGEREF _Toc515791566 h 15 HYPERLINK l _Toc515791567 附录3 PAGEREF _Toc515791567 h 15 HYPERLINK l _Toc515791568 附录4 PAGEREF _Toc515791568 h 16马铃薯StUBC30基因的克隆及表达载体的构建摘要：泛素结合酶E2是蛋白质翻译后修饰的重要方法，有研究证明E2与各种生理过程和生物过程有关，如：干旱胁迫、盐胁迫、植物的生长发育等。在这个实验中，用马铃薯（Solanum tuberosum L.）大西洋（Atlantic）品种为研究对象，

9、分别提取了马铃薯不同器官中的总RNA，使用紫外分光光度计测定RNA的纯度和浓度，用琼脂糖凝胶电泳技术分析出所提取RNA样品的完整性，然后合成cDNA的第一链；使用PCR扩增技术扩增出StUBC30基因，构建T-18克隆载体并导入到大肠杆菌DH5，StUBC30基因的阳性克隆载体通过蓝白色斑筛选获得，之后进行双酶切，将目的基因与CPB表达载体连接并导入大肠杆菌DH5，提取质粒再次进行双酶切，并在公司测定阳性克隆载体和阳性表达载体序列。双酶切结果显示：小片段和大片段的大小与目的片段大小及空载体片段大小一致；测序结果表明：目的基因的CDS区与测序结果完全一致未发生碱基突变，表明PMD-StUBC30

10、克隆载体及CPB- StUBC30过表达载体构建成功，为后续研究干旱胁迫下马铃薯StUBC30基因的应答机制提供实验材料。关键词：马铃薯；泛素化；干旱；StUBC30Cloning of Potato StUBC30 Gene and Construction of its expression VectoFuXue（Major in Biotechnology in the College of Life Science and Technology of Gansu Agricultural University，Gansu Lanzhou，730070）Abstract: Ubiquit

11、in-conjugation enzyme is one of the important methods of protein posttranslational modification, Studies have shown that E2 is associated with a variety of physiological and biological processes. Such as drought stress, salt stress, plant growth and development, etc. In this experiment, the potato v

12、ariety Atlantic was used as the research object. The total RNAs in the root, stem and leaf of potato plantlets were extracted. The purity and concentration of RNA were determined by ultramicro ultraviolet spectrophotometer. Agarose gel electrophoresis was used to analyze the integrity of RNA samples

13、. The first cDNA strand was synthesized;StUBC30 gene was obtained by PCR amplification, and T-18 clone vector was constructed and introduced into DH5 of Escherichia coli. The positive clone vector of StUBC30 gene was obtained by blue and white spot screening, After double enzyme digestion, the targe

14、t gene was ligated into the CPB expression vector, then introduced into Escherichia coli DH5 , the plasmid was extracted and verified by double enzyme digestion. Positive cloning vectors and positive expression vectors were then sent to the company for sequencing. The results of double enzyme digest

15、ion showed that the size of the small fragment and large fragment was the same as that of the target fragment and empty vector fragment, and the result of sequencing showed that there was no base mutation in the CDS region of the target gene. The results showed that the PMD-StUBC30 clone vector and

16、CPB- StUBC30 overexpression vector were successfully constructed, which provided experimental materials for further study on the response mechanism of potato StUBC30 gene under drought stress.Key words: Potato; ubiquitin; drought;StUBC30前言马铃薯（Solanum tuberosum L.）别称土豆、洋芋、地蛋等，是公认的四大粮食作物之一，也是继谷类，豆类，蔬菜

17、，肉类的第五大主食。种植面积仅次于小麦，玉米和大豆，是一种结合了谷物，蔬菜，食品和工业原料的植物。马铃薯富含人体所必需的多种营养物质，据不完全统计全国已超过500多万公顷1；总产量呈上升趋势，全国已超过1亿吨，位居世界之首，按粮食当量 41 计算，折合年生产粮食 2500万吨。人工种植马铃薯的历史久远，最早可追寻到公元前8000年至公元前5000年的秘鲁南部 2，在中国也有400多年的种植历史。马铃薯在中国有四大产区，分别是：西南、西北、内蒙古和东北地区，位于西北地区的定西，以其海拔高、气温低、温差大等独特的自然条件和特殊的地理条件，使之成为我国三大最重要的马铃薯种植区之一3。甘肃省定西市安定

18、区被称为“中国马铃薯之乡” ，甘肃省渭源县被誉为“中国马铃薯良种之乡”。定西市位于甘肃中部，气候类型为半干旱气候，年平均降雨量在350mm左右，占比不到全国平均降雨量的三分之一，但却有着1400mm之多的蒸发量。每年因干旱使农作物产量以2%的减幅下降4 ，经济损失达数百万元。干旱分为两种，其中一种为土壤干旱，指土壤含水量下降，水势比植物体水势低，植物体因缺水而造成伤害；其二是大气干旱，指空气中水分含量低，伴随着高温和太阳辐射以及干热风，植物体蒸腾加快，根系吸水较少，使植物体内含水量下降而造成危害。这两种干旱在不同程度上都会因植物体内水分不足对农作物的产量和品质造成较大影响。以小麦为例，如果在生

19、长前期干旱，造成出苗率不一，甚至无法出苗；在生长期缺水会使小麦植株分蘖数和根系数减少，叶片细弱，甚至发黄、干枯，植株的抗逆性下降；在成熟期干旱会使小麦籽粒不能正常灌浆，籽粒干瘪，造成减产5。泛素( ubiquitin，UB) 是一种序列高度保守蛋白质小分子，通常由76个氨基酸残基组成，在真核生物中最为多见6。泛素化指泛素在多种酶的共同作用下使其结合到目的蛋白上的修饰加工过程，此过程包括3种重要的酶，分别是泛素活化酶 E1 (ubiquitin-activating enzyme)、 泛素结合酶E2 (ubiquitin-conjugation enzyme，UBC)以及泛素连接酶 E3 (ub

20、iquitin-protein ligase)。首先，泛素分子被ATP激活连接到泛素活化酶 E1的半胱氨酸残基上7，之后泛素活化酶 E1将泛素分子转移到泛素结合酶E2上8，然后泛素结合酶E2将泛素分子转移到连有底物蛋白的泛素连接酶 E3的亮氨酸残基上9。最终的泛素-蛋白复合物绝大多数被沉淀系数为26S的蛋白酶体所识别和降解，少数一些被溶酶体和囊泡中的酶降解。同时,泛素C末端水解酶 ( UBC terminal hydrolase) 释放出泛素供回收利用。泛素化修饰参与各种反应机制，如细胞周期调控、细胞分化、凋亡、DNA 损伤修复等 10，为植物体适应各种非生物胁迫（干旱、盐碱、洪涝、高温等）不

21、良环境条件提供重要保障11。泛素结合酶（UBC，E2）是泛素激活酶（E1）接受泛素并将其转移到靶蛋白上的关键酶，在依赖泛素/ 26S蛋白酶体的蛋白水解中发挥着重要作用。E2含有一个保守结构域，大约140个氨基酸残基，UBC由此而的名。据报道，UBC涉及植物的非生物胁迫，其中包括干旱，盐，渗透和水分胁迫等11。研究表明，E2是多基因家族：人类基因组中约有50个E212，水稻中有48个E213，玉米中有75个E214，秀丽隐杆线虫中有20个E215，酿酒酵母中含有13个E216，香蕉中有72个E217，番茄中有59个泛素E218。包含附加到UBC2域的可变的N或C末端扩展的E2更常见，因此E2家族

22、分为四类：I类，仅限于UBC2域；II类，UBC基因 C末端扩展；III类，UBC2加N末端扩展；IV类，UBC加上N和C端扩展19。Zhou20等以大豆为研究材料，克隆出UBC2基因GmUBC2，与对照植物相比，过表达的GmUBC2转基因模式植物在耐盐度和抗旱性方面能力更强。赵瑞丽等以小白菜为研究对象，发现在铜胁迫下小白菜中的BcUBCE2基因表达量上升，由此可见该基因能够提高植物的抗逆能力21。GmUBC2与马铃薯StUBC30是同源基因，虽然已经证明GmUBC2参与植物抗逆过程，但对于马铃薯中其同源基因StUBC30的研究却从未见报道。因此，在干旱胁迫下研究StUBC30马铃薯反应机制的

23、机制至关重要。本实验通过PCR扩增获得目的基因，成功构建了具有Amp抗性的StUBC30基因克隆载体，构建并筛选出具有Kanamycin抗性的StUBC30基因表达载体, 为后续实验提供原材料，并为马铃薯遗传育种提供技术支持。并将对其进行验证，从而为马铃薯的遗传育种和后续实验提供一定的理论依据。1 材料与方法 1.1 材料与试剂1.1.1 材料 以栽培于MS液体培养基的“大西洋”试管苗为材料，此材料由甘肃农业大学作物遗传改良与种质创新实验室提供的。1.1.2 仪器与试剂 主要仪器：立式高压灭菌锅；5402离心机(德国Eppendorf公司)；凝胶成像分析系统（美国UVP）；PCR扩增仪；移液枪

24、；恒温摇床培养箱；生化培养箱。主要试剂：总RNA提取试剂盒； cDNA第一链合成试剂盒；质粒小提试剂盒；无水乙醇、氯仿等均采用分析纯。1.2 方法1.2.1 StUBC30基因引物的查询与设计在NCBI（/）中对比查询马铃薯StUBC30基因的核苷酸序列，设计并合成基于基因序列的一对引物以扩增整个开放读数（CD）区域，使用DNAMAN软件分析基因序列找出不能在基因内进行酶切处理的限制性核酸内切酶，从StUBC30基因中选取两种内切酶，分别为Sac 和BamH ，在引物5端加上酶切位点，在酶切位点前添加保护碱基。1.2.2 马铃薯试管苗的培养在超净工作台中剪取长约1cm的大西洋试管苗茎段，后将剪

25、取的茎段接种到MS培养基中，置于培养室中培养20天。（培养条件:温度为25左右，光周期：16h/d，光照强度2000Lx）1.2.3 马铃薯RNA的提取与cDNA链的合成选择茎干粗壮，叶片长势茂盛的大西洋试管苗为实验材料，提取马铃薯试管苗的总RNA，并用TIANGEN第一链cDNA合成试剂盒合成cDNA（具体步骤见附录一与附录二）。1.2.4 马铃薯StUBC30基因的PCR扩增以上述合成的cDNA为模板，扩增StUBC30基因，操作步骤如下：（1）在无菌的PCR管中按以下组分加入：试剂体积Mix11 LStUBC30-F1 LStUBC30-R1 LddH2O6 LcDNA1 L将上述样品用

26、移液枪轻轻混匀后，离心10s使样液聚集在PCR管底部，放置于PCR扩增仪中进行扩增，扩增条件如下：过程温度时间预变性944min变性9430s退火55-6030s延伸721min终延伸728min保存499min（3）吸取步骤2获得PCR产物进行琼脂糖凝胶电泳，确定StUBC30基因的最适应扩增温度。（4）将步骤2中的退火温度设为最适温度后，再次扩增。1.2.5 PCR产物的回收纯化PCR产物，使用普通琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒（具体步骤见附录3）。将回收的PCR产物放置于-20冰箱保存。1.2.6 T18载体连接冰浴融化保存在冰箱中的StUBC30基因，并将其克隆载体PMD18-T连接，操作

27、步骤如下：（1）在无菌的PCR管中加入以下组分：试剂体积PMD18-T1LPCR产物4LSolution 5L（2）将样品混匀后离心3s；（3）在温度为16的PCR仪中反应30min。1.2.7 连接产物的转化含有StUBC30基因的重组载体导入到大肠杆菌感受态细胞DH5中，操作如下：从超低温冰箱中取出200l大肠杆菌感受态细胞，冰浴1分钟；吸取10L连接产物，滴加到微微化冻的大肠杆菌感受态细胞菌液中央，冰浴30min；在42的水浴锅中水浴45s，之后冰浴1min；在样品中加入890L的LB液体培养基，室温放置5min之后在37的恒温摇床中黑暗培养1h（260r/min）将100ml固体LB培

28、养基于微波炉中融化，待温度达到50左右时加入2mg/ml IPTG、200ug/ml X-gal和1mg/ml的Amp，摇匀分装到4个培养皿；在步骤5所得到的平板中分别加入60 L、70 L、80 L、90L的样品，用涂菌棒涂抹均匀。在37恒温培养箱中倒置放置，培养一夜；待平板上长出表面光滑，边缘略有透明的菌斑后，用挑菌针挑选独立的、表面光滑的菌落接种至装有5ml LB液体培养基的离心管中，在37摇床中培养一夜，转速为260r/min。在无菌条件下吸取适量菌液进行PCR扩增和后续实验。1.2.8 阳性克隆的测序与序列分析将PCR检测到的带有目标条带的菌液送到公司进行测序，将测序结果与StUBC

29、30基因进行比较，并存储序列一致的送测样品。1.2.9 表达载体的构建（1）选用序列一致的菌液提取质粒。（具体方法见附录4）（2）分别对克隆载体StUBC30和表达载体CPB进行双酶切，体系如下：StUBC30双酶切体系：试剂体积Sac 3LBamH 3L绿buffer6L质粒42LddH2O6LCPB双酶切体系：试剂体积Sac 3LBamH 3L绿buffer6L质粒11LddH2O37L（3）在温度为37 和80 的PCR仪中分别反应20 min，5 min；（4）对已经完成双酶切的产物进行凝胶电泳检测，将预留凝胶片段用普通琼脂糖凝胶DNA试剂盒进行回收（具体步骤见附录3）；（5）用T4D

30、NA连接酶将已经酶切的克隆载体StUBC30和表达载体CPB进行连接，反应体系如下：试剂体积VUBC303.24LVCPB1.76L5xT4DNA ligase Buffer2LT4DNA ligase1LddH2O2LPCR仪中25条件反应25min。1.2.10 连接产物的检测（1）将上述连接产物导入大肠杆菌感受态细胞DH5中，并使用卡那霉素选择出阳性表达载体；（具体步骤见1.2.7 ）（2）对上述PCR产物进行检测（具体步骤见1.2.8）2 结果与分析2.1 RNA纯度的测定结果 表 1总 R N A 的紫外分光光度计检测结果Table 1 Spectrophotometer analy

31、sis of total RNA样品编号OD260/OD280OD260OD230浓度（ngL）D0G2.111.831958.52D0Y2.091.782833.01D1G2.021.721673.25D1Y2.141.82704.57D2G1.991.83870.15D2Y1.871.613393.51D4G21.63018.1D4Y1.991.55470.4D8G1.881.631178.7D8Y1.931.673270.1D16G2.051.822265.68D16Y21.743058.99OD260OD280比值是检测RNA纯度的重要指标。高质量的RNA OD260OD280比率介于

32、1.8和2.1之间，纯RNA为2.0。经超微量紫外分光光度计检测，检测结果见表1，由表1可知：所提取RNA的OD260D280的数值接近2.0，且OD260OD230也在1.72.0之间，结果表明提取的RNA具有较高的纯度和较低的蛋白质含量，有效地排除了多糖和酚类的干扰，证明RNA的纯度较高。2.2 RNA的凝胶电泳结果 18s 18s 28s 图1马铃薯不同器官RNA的凝胶电泳图片Fig.1 Gel electrophoresis pictures of RNA in different organs of potato取适量RNA提取液进行凝胶电泳检测，电泳结果如图1所示。可以看到，提取的

33、根的总RNA，其28S和18S条带带型清晰，两条带之间没有发生扩散现象，表明在提取过程中RNA的结构是完整的，基本上消除了RNA酶的污染，并且没有发生显著的降解，可用于cDNA第一链的合成。2.3 目的基因凝胶电泳结果100bp250bp500bp750bp1000bp2000bp100bp250bp500bp750bp1000bp2000bp图2 StUBC30基因凝胶电泳图Fig.2 StUBC30genegelelectrophoresis所扩增的StUBC30目的基因用凝胶电泳检测的结果如图2所示，其大小近似于500 bp，说明所合成的产物与目的基因片段大小一致，可进行后续的验证实验。

34、2.4 克隆载体构建及其送测结果 图3克隆载体蓝白斑筛选结果Fig.3 Screening results of clone vector blue and white spotUBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列UBC30原序列送测样品序列图4克隆载体送测结果Fig.4

35、 Cloning vector transmission results将所得到的克隆载体进行摇菌并将所得到的菌液涂板进行蓝白斑筛选，结果如图3所示。由图3可知，所培养的菌株既有阳性克隆菌株又有假阳性克隆菌株，挑选其中一些表面光滑的阳性克隆继续培养，为后续实验做准备。将获得菌液送往公司测序，测序结果如图4所示。由图看得出以下结果：所得到的克隆载体序列与 UBC30基因原序列比对结果一致，没有发生突变，证明所得到的序列为目的基因的全部序列。2.5 双酶切结果20002000bp500250100图5双酶切电泳图Fig.5 Double enzyme electrophoresis diagram

36、.对所得到的StUBC30克隆载体和CPB表达载体进行双酶切实验，结果如上。从图中可看出克隆载体StUBC30基因大小在500bp-750bp之间，表达载体CPB分子量在10000左右，并且条带清晰，无拖尾现象出现，与预期的片段大小相一致。2.6 目的片段与表达载体连接结果 图6连接产物平板图Fig.6. Target segment and expression carrier connected product tablet diagram (注释：在实验过程将该基因重新命名为StUBC30)图7目的片段与表达载体连接电泳图Fig.7 Objective the fragment is c

37、onnected to the expression carrier electrophoresis map将双酶切所得到的目的片段与表达载体进行连接，并通过验证得到以下结果：连接产物涂板菌落单一且菌落表面光滑说明连接成功；菌落凝胶电泳图中条带在500-750bp之间与预期结果相差无几。3 讨论 泛素-蛋白酶体途径可以通过泛素化降解与胁迫信号有关的成分应对产生的各种非生物胁迫22。泛素26S蛋白酶体介导的蛋白质特异降解途径对植物抵御非生物胁迫有着重要的作用23。其中泛素化途径中的泛素结合酶E2 (ubiquitin-conjugation enzyme，UBC)是泛素化中从泛素激活酶E1接受泛

38、素，再将泛素转移到泛素连接酶E3的关键酶。E2是一个多基因家族，在模式植物拟南芥中有37个，据结构和功能的不同可将其分为四类： 类仅含有 UBC结构，类含有 UBC结构和 N端延长，类含有 UBC结构和 C端延长， 类含有 UBC结构 C端延长和 N端延长。泛素结合酶E2能够与一些特定的顺式作用元件结合以提高植物的抗逆能力。 有研究表明，当植物在受到外界非生物胁迫（干旱、盐碱、洪涝、高温等）等不良环境的时候泛素结合酶可以 通过改变自身的表达量的多少和改变一些信号通路等方法使植物体能够适应外界的不良环境， 以免对植物体造成较大的伤害。 本实验成功构建了马铃薯StUBC30的克隆载体和过表达载体为

39、后续马铃薯StUBC30基因功能的分析奠定了基础。参考文献1庞昭进,郭安强,杨建忠等.关于马铃薯主食化的思考J.河北农业科学,2017,21(05):91-93.2蔡兴奎,谢从华.中国马铃薯发展历史、育种现状及发展建议J.长江蔬菜,2016(12):30-33. 3李沛文，何水清，张强定西市安定区发展马铃薯产业的调研报告 J甘肃农业，2013（23）：3-64王勤, 农业经济综述粮食生产J. 王文生主编,甘肃年鉴,中国文史出版社,2017,120,年鉴.5黄聪敏,朱勇,温建荣等.干旱对农作物的影响以连州市为例J.吉林农业,2011(09):157-158.6张燕,郑兴.DAXX的泛素化和去泛素

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