临床基因扩增检验操作规范培训课件

1、临床基因扩增检验操作规范临床基因扩增检验操作规范一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能二、各阶段操作要求三、PCR污染与对策四、因操作欠规范导致的问题分析临床基因扩增检验操作规范2一、临床基因扩增检验实验室的临床基因扩增检验操作规范2一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其各室的功能 规范化设置： 要求参照临床基因扩增检验实验室管理暂行办法（卫医发2002 10号文）附件临床基因扩增检验实验室基本设置标准。 临床基因扩增检验操作规范3一、临床基因扩增检验实验室的 规范化设置及其 1. 四个隔开的工作区域中每一区域都须有 专用的仪器设备。 2. 明确的标记，如加样器或试剂等。

2、 3. 单一方向顺序，从试剂贮存和准备区、 标本 制备区、扩增反应混合物配制和扩增区（简 称扩增区）至产物分析区。 4. 使用不同颜色或有明显区别标志的工作服。 5. 实验室的清洁应按试剂贮存和准备区至扩增 产物分析区的方向进行。 6. 各自的清洁用具。临床基因扩增检验操作规范4 1. 四个隔开的工作区域中每一区域都须有临床基因扩增 各室功能：临床基因扩增检验操作规范5 各室功能：临床基因扩增检验操作规范5（一）试剂贮存和准备区 功能： 贮存试剂的制备、试剂的分装和主反应混合液的制备。 临床基因扩增检验操作规范6（一）试剂贮存和准备区 功能：临床基因扩增检验操作规范6 含反应混合液的离心管或试

3、管在冰冻前都应快速离心数秒。 戴手套。 工作结束后必须立即对工作区进行清洁。实验台表面，使用可移动紫外灯（254nm波长）照射，一般照射过夜。 实验室及其设备的使用必须有日常记录。 临床基因扩增检验操作规范7 含反应混合液的离心管或试管在冰冻前都应（二）标本制备区 功能： 临床标本的保存，核酸（RNA、DNA）提取、贮存及其加入至扩增反应管和测定RNA时cDNA的合成。 临床基因扩增检验操作规范8（二）标本制备区 功能：临床基因扩增检验操作规范8 要正确使用加样器。 正压条件避免从邻近区进入本区的气溶胶污染。 为避免样本间的交叉污染，加入待测核酸后，必须盖好含反应混合液的反应管。 对具有潜在传

4、染危险性的材料，必须有明确的样本处理和灭活程序。 用过的加样器吸头必须放入专门的消毒容器内。 用于RNA扩增检测的样本制备好以后，应立即进行cDNA合成。 临床基因扩增检验操作规范9 要正确使用加样器。临床基因扩增检验操作（三）扩增区 功能： DNA或cDNA扩增。 临床基因扩增检验操作规范10（三）扩增区 功能：临床基因扩增检验操作规范10 已制备的DNA模板和合成的cDNA的加入和主反应混合液制备成反应混合液等也可在本区内进行。 在巢式PCR测定中，第二次加样必须在本区内进行。 可降低本区的气压以避免气溶胶从本区漏出。 如有加样则应在超净台内进行。 打开反应管前快速离心数秒。临床基因扩增检

5、验操作规范11 已制备的DNA模板和合成的cDNA的（四）扩增产物分析区 功能： 扩增片段的测定。 临床基因扩增检验操作规范12（四）扩增产物分析区 功能：临床基因扩增检验操作规范 膜上微孔板上探针杂交方法、 Southern转移、琼脂糖凝胶电泳、聚丙烯酰胺凝胶电泳、核酸测序方法等。 本区是最主要的扩增产物污染来源。溴化乙锭、丙烯酰胺、甲醛或同位素等有毒或致癌物质，注意实验人员的安全防护。 负压条件。临床基因扩增检验操作规范13 膜上微孔板上探针杂交方法、 Sout二、各阶段操作要求 测定分析前的标本采集处理、测定中的核酸提取、扩增和产物分析以及测定后的结果报告等。临床基因扩增检验操作规范14

6、二、各阶段操作要求 测定分析前的标本采（一）标本的采集 临床标本包括EDTA或枸橼酸钠抗凝全血或骨髓、血清或血浆、痰、脑脊液、尿及分泌物等。 EDTA和枸橼酸盐是首选的抗凝剂。不能使用肝素抗凝，因肝素是Taq酶的强抑制剂。 玻璃器皿在使用前应高压处理，250烘烤4小时以上可使RNA酶永久性失活。 临床用于RNA（如HCV RNA）扩增检测的血标本应尽快（3小时以内）分离血浆，以避免RNA的降解。临床基因扩增检验操作规范15（一）标本的采集 临床标本包括EDTA（二）标本的稳定化处理 DNA：不需特殊稳定化处理。 RNA：异硫氰酸胍盐（GITC）可使 DNA酶和RNA酶失活。 临床基因扩增检验操

7、作规范16（二）标本的稳定化处理 DNA：不需特殊稳定化处理。临床（三）标本的运送 可在常温下通过邮寄运送，如用于DNA扩增检测的EDTA抗凝全血及用于RNA扩增检测的GITC稳定化处理的标本。 未经稳定化处理，则必须速冻后，放在干冰中运送。 临床基因扩增检验操作规范17（三）标本的运送 可在常温下通过邮寄运（四）标本的贮存1. 血清/血浆等 -70 2. 用于DNA测定的已纯化核酸样本 43. 用于RNA测定的已纯化核酸样本 -80 4. 用乙醇沉淀的核酸样本 -20 5. GITC处理的RNA标本在室温可保存7天 临床基因扩增检验操作规范18（四）标本的贮存1. 血清/血浆等 -70 临床

8、基因扩（五）标本的处理（核酸提取） 抑制物可能来源于： 标本本身（如血红素及其前体或降解产物）。 核酸提取过程中残留的有机溶剂（如酚、氯仿等）。 痰须液化处理。 临床基因扩增检验操作规范19（五）标本的处理（核酸提取） 抑制物可能来源于：临床基因 操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）注意：离心管不能插得过低，以防进水；水浴时不能加盖，防管盖爆开；水浴时间须准确，101 min； 水浴时不能走开；左右手分开，左手只接触样本，右手只接触加样器及操作仪器。临床基因扩增检验操作规范20 操作时（加裂解液后充分混匀，沸水浴）临床基因扩（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增 有多种因素可引起核酸扩增检测假阴性

9、结果，如扩增靶核酸中抑制剂存在、Taq酶失活、退火温度不对、Mg+浓度不佳、患者标本或试剂受污染等。 扩增仪孔中热传导的均一性极为重要。 临床基因扩增检验操作规范21（六）靶核酸的逆转录（RT）和扩增 有多RT-PCR操作注意：标本必须新鲜；做RNA标本的枪头离心管必须无菌；冰上操作；处理完后须立即上机，不能放置；注意左右手分开。临床基因扩增检验操作规范22RT-PCR操作注意：标本必须新鲜；临床基因扩增检验操作规（七）扩增产物的分析 扩增产物的测定有各种方法，如电泳、限制性酶切、斑点印迹、探针杂交、测序、分光光度法定量等。临床基因扩增检验操作规范23（七）扩增产物的分析 扩增产物的测定有实时

10、荧光定量PCR在荧光定量PCR基础上实时监测PCR全过程，最后通过曲线进行定量分析。与一般荧光定量PCR使用荧光强度定量不同，实时荧光PCR一般使用Ct（每个反应荧光信号达到设定域值所经的循环数）定量，Ct与模板初始拷贝数的对数成线性关系。实时荧光PCR的优点：精密度高，重复性能好。临床基因扩增检验操作规范24实时荧光定量PCR在荧光定量PCR基础上实时监测PCR全过程TaqMan荧光定量PCR原理探针两端分别用荧光基团和淬灭基团标记，因为距离相近，基团相互作用，不产生荧光；探针与模板杂交在引物区间内，当扩增进行时，Taq DNA聚合酶的5-3外切酶活性降解探针，荧光基团和淬灭基团分开，受激产

11、生荧光信号；荧光信号强度与扩增产物量成正比；临床基因扩增检验操作规范25TaqMan荧光定量PCR原理探针两端分别用荧光基团和淬灭临床基因扩增检验操作规范26临床基因扩增检验操作规范26临床基因扩增检验操作规范27临床基因扩增检验操作规范27三、PCR污染与对策PCR污染分环境污染与反应液污染二种。常见PCR污染源有三个：第一、标本间的交叉污染；第二、实验室中克隆质粒的污染；第三、PCR产物的污染（Carryover）。临床基因扩增检验操作规范28三、PCR污染与对策PCR污染分环境污染与反应液污染二种。常要防止PCR污染，必须做好以下3个环节的工作：（一）污染的预防（二）污染源的追踪（三）污

12、染源的处理临床基因扩增检验操作规范29要防止PCR污染，必须做好以下3个环节的工作：临床基因扩增检（一）污染的预防操作PCR时，按照下述规则可有效地预防PCR的污染。1、PCR的前处理及后处理要在不同的隔 离工作台上或房间内进行。2、分装试剂，标记批号临床基因扩增检验操作规范30（一）污染的预防操作PCR时，按照下述规则可有效地预防PCR3、改进实验操作： (1) 带一次性手套； (2) 避免反应液的飞溅； (3) 用一次性移液器或吸头，吸头不要暴露于 空气，以免产物气溶胶污染； (4) 操作多份样品时，要先将可混匀的成分 (dNTPs，缓冲液，引物等)一起制备标准 混合液(Master mi

13、x)； (5) 制备反应混合液时，最后加入样品DNA， 加入DNA后，在进行下一步操作前要盖紧 反应管。4、检查结果的可重复性。临床基因扩增检验操作规范313、改进实验操作：临床基因扩增检验操作规范31（二）污染源的追踪临床基因扩增检验操作规范32（二）污染源的追踪临床基因扩增检验操作规范321、阳、阴性对照 选择阳性对照时，应选择扩增弱， 且重复性好 的样品。 阴性对照的选择一定要小心。 不含模板DNA的PCR试剂对照。临床基因扩增检验操作规范331、阳、阴性对照临床基因扩增检验操作规范332、常见的环境污染源有 (1) 点杂交的点样器；(2) 切片机；(3) 离心机；(4) 切胶用刀或微解

14、剖刀；(5) 浓缩用具，真空瓶；(6) 电泳装置和紫外灯箱；(7) 干冰/乙醇或水溶锅；(8) 冰箱门把手、冷冻架和门把手。 临床基因扩增检验操作规范342、常见的环境污染源有 (1) 点杂交的点样器；临床基因扩追踪可疑的环境污染源 用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分 在0.1ml 去离子水中浸泡； 取5l 作PCR反应； 电泳检查结果。临床基因扩增检验操作规范35追踪可疑的环境污染源 用去离子浸湿的灭菌棉签擦试可疑部分（三）污染源的处理临床基因扩增检验操作规范36（三）污染源的处理临床基因扩增检验操作规范361. 环境污染处理法（1）稀酸处理法。 对擦试实验阳性部位或器件可用1mol/LHC

15、l擦洗或浸泡残留DNA。（2）紫外法： UV照射波长一般选择254/300nm，需考虑PCR产物的长度与产物序列中碱基的分布。UV对长片段（500bp以上）有效，而对短片段效果不大。 临床基因扩增检验操作规范371. 环境污染处理法（1）稀酸处理法。临床基因扩增检验操作规2. 反应液的污染处理法(1) DNaseI法： PCR混合液（不加模板和Taq酶）中加入0.5U DNaseI，室温下作用30min后，加热灭活，加入模板和Taq酶后即可进行正常PCR。 优点：便宜，不需知道扩增DNA序列。临床基因扩增检验操作规范382. 反应液的污染处理法(1) DNaseI法：临床基因扩(2) 内切酶法

16、： 选择识别四个碱基的内切酶（如MspI等），最好几种合用，可克服其识别序列特异的缺陷。方法同上，只是DnaseI由内切酶（MspI10U）代替，作用时间延长到1.01.5h。(3) 紫外照射法： 反应中不加模板与Taq酶。 临床基因扩增检验操作规范39(2) 内切酶法：临床基因扩增检验操作规范39(4) 尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法： dUTP代替反应中的dTTP，使产物中含大量dU，UNG可去除dU，使失去dU的位置，阻止Taq酶的延伸。PCR正常循环前，用UNG处理PCR反应混合液可消除PCR产物的污染，而UNG在正常PCR循环变性一步就会失活，所以，对含dU的新合成PCR产物没有影

17、响 。临床基因扩增检验操作规范40(4) 尿嘧啶DNA糖基化酶（UNG）法：临床基因扩增检验 T A T A T A T A T A PCR A U A U A U UNG A A A 加热 A A A PCR临床基因扩增检验操作规范41临床基因扩增检验操作规范41该法优点： 去除任河来源（包括引物在内）的 污染； 由于污染的产物有大量dU存在， 因此，UNG处理会彻底消除污染。 UNG处理与PCR扩增可在同一试管 内进行。 临床基因扩增检验操作规范42该法优点：临床基因扩增检验操作规范42四、因操作欠规范导致的问题分析临床基因扩增检验操作规范43四、因操作欠规范导致的问题分析临床基因扩增检验

18、操作规范43（一）实验室仪器设备1、设备不齐全、不配套，使得实验结果不稳定，引起假性结果。 旋涡混合器，微量加样器，正规的紫外透射仪。 RNA PCR样品处理时，血清（或血浆）中加入强 烈变性剂后，血样中的蛋白变性、结块。 吸头与微量加样器不配套。2、PCR热循环仪的差异或质量问题。临床基因扩增检验操作规范44（一）实验室仪器设备1、设备不齐全、不配套，使得实验结果不稳移液器：严禁大力来回拧动；严禁调至容量之外使用；第二档为排空档，不得作吸取之用；吸头应浸入液面23mm处吸取；严禁将有液体的移液器平放或倒置；混匀沉淀时，将吸头紧贴于沉淀上方管壁，反复吸取液体，将沉淀反复混匀，溶解；每周用75%

19、乙醇清洗一次，若有污染随时清洗。临床基因扩增检验操作规范45移液器：严禁大力来回拧动；临床基因扩增检验操作规范45离心机：离心前，离心管须配平；将调速档打至0档位，才能打开电源开关，逐渐升高转速，直至即定转速；定时旋钮不能强行归零；转头未停止时，严禁打开盖板。临床基因扩增检验操作规范46离心机：离心前，离心管须配平；临床基因扩增检验操作规范46临床基因扩增检验操作规范培训课件（三）PCR操作中存在问题分析1.阳性变阴性2.阴性变阳性3.PCR结果不稳定临床基因扩增检验操作规范48（三）PCR操作中存在问题分析1.阳性变阴性临床基因扩增检验1.阳性变阴性 (1) 有些阳性病人，经过PCR检测后为

20、阴性，可能有两种情况： 一是采集标本方法或部位不正确， 二是如果病人取样部位病原体消失，需根据病人的病理情况采样。临床基因扩增检验操作规范491.阳性变阴性 (1) 有些阳性病人，经过PCR检测后为阴(2) 标本保存不当，可引起PCR失败。 收集的标本乱放（未放冰箱），病原体的破裂，检测的核酸降解，失去了PCR检测的模板或造成标本污染。临床基因扩增检验操作规范50(2) 标本保存不当，可引起PCR失败。临床基因扩增检验操作2.阴性变阳性 常见的原 因有以下6点： 临床基因扩增检验操作规范512.阴性变阳性临床基因扩增检验操作规范51 加入试剂或样品时引起的交叉污染 （最好在加完所有其他反应成分

21、，包括防止蒸发用的矿物油后才吸加模板DNA，将模板加入微量离心管后，盖好离心管并用戴有手套的手指轻轻单击管侧壁，以摇匀液体，再作瞬时离心10秒，使水相和有机相分开）。 临床基因扩增检验操作规范52 加入试剂或样品时引起的交叉污染临床基因扩增检验操作规范5加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤筛的吸头避免污染 （将模板DNA加入PCR系统时，注意切勿形成喷雾，后者有可能污染别的反应，所有并非即用管都应盖严）。 临床基因扩增检验操作规范53加样器通道易形成气溶胶，造成加样器通道污染，可通过使用有滤 打开标本管盖引起样品飞溅 （打开前须瞬间离心）操作时手套引起的交叉污染 （拿过模

22、板DNA管后应更换手套） 临床基因扩增检验操作规范54 打开标本管盖引起样品飞溅临床基因扩增检验操作规范54不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染 （必须设置一个不含模板DNA但含PCR系统中所有其他成分的对照反应。这一对照管须在准备好所有其他PCR以后才进行吸加）。实验室污染 临床基因扩增检验操作规范55不明原因引起公用试剂如液体石蜡等污染临床基因扩增检验操作规3. PCR检测结果不稳定（1）样品处理方法不当，标本中杂质很多， 血清标本有蛋白质、血红素、代谢产物等。 蛋白质DNA电泳带拖尾 血红素中的卟啉化合物抑制Taq酶活性 代谢产物干扰引物配对 临床基因扩增检验操作规范563. PCR检测结果不稳定临床基因扩增检验操作规范56（2）操作不当带来的后果 主要指不能严格按照说明进行操作造成PCR检测失败。 如HCV R