目的基因的制取课件

1、第六章 基因文库的构建与目的基因的获得一、目的基因 通常把插入到载体内的特定基因片段称为“外源基因”，而将被分离、改造、扩增或表达的特定基因或DNA片段，称为“目的基因”。 基因工程的主要工作是在体外将感兴趣的DNA片段（目的基因）与载体DNA连接起来，形成重组DNA分子，再导入适当的表达体系进行表达，产生特定的基因产物。所以，分离获取目的基因，是基因工程的第一步工作。二、基因文库基因组文库:由基因组DNA制成的基因文库。cDNA文库:由互补DNA制成的基因文库。 基因文库是否具有代表性，是看文库是否覆盖起始材料的全部基因或序列而未因克隆操作丧失其中的基因或序列。三、基因组文库的构建1. 基因

2、组文库 将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片段，并将所有这些片段都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。理论上讲，一个完整的基因文库含有染色体基因组DNA的全部序列的各种片段。Genomic DNA Cloning2. 构建基因文库的载体选用载体能够容载的DNA片段大小直接影响到构建完整的基因文库所需要的重组子的数目。（1）对载体的要求载体容量越大，所要求的DNA片段数目越少，所需的重组子越少。（2）目前常用的载体载体系列： 容量为24 kpcosmid载体： 容量为50 kbYAC： 容量为100 kbBAC: 容量为300 kb（2）随机片段化 限制性内切酶局部消

3、化法 控制内切酶的用量和消化时间，使基因组中的酶切位点只有一部分被随机切开。 机械切割法 . 超声波：超声波强烈作用于DNA，可使其断裂成约300bp的随机片段。 .高速搅拌：1500转/分下搅拌30min，可产生约8kb的随机片段。 限制酶局部消化的理论依据是：酶切速度是不均衡的。内切酶Sau3A进行局部消化，可得到10-30kb的随机片段。 4.基因组文库的大小 一个文库要包含99%的基因组DNA时所需要的克隆数目。 N：所需的重组载体数（克隆数）p: 文库包含了整个基因组DNA的概率（99%） f: 插入载体的DNA片段的平均长度占整个基因组 DNA的百分数 G：Genome大小； f：

4、fragment大小 较大的插入片段、较小的基因组可减少重组体的数量。 例如：大肠杆菌和人类的基因组分别是4.6106bp、3109bp，若插入DNA片段的平均长度如果是20kb ,则N E.coli=1.06103 N人类= 6.9105 有哪些可能的原因使一个基因在DNA库中丢失？假定这个基因在高拷贝数的载体上，由于它的产物太多，而对宿主是有毒的；在部分消化中，某个基因中含有所用酶的切点；酶切位点离基因太远，结果由于DNA片段太长而不能有效地克隆。 2. cDNA文库的特点 （1）不含内含子序列。 （2）可以在细菌中直接表达。 （3）包含了所有编码蛋白质的基因。 （4）比DNA文库小的多，

5、容易构建。 3.构建cDNA文库的一般步骤 （1）总RNA提取。（kit） （2）mRNA的分离纯化 原理 利用mRNA都含有一段polyA尾巴，将mRNA从总RNA （rRNA、tRNA等）中分离纯化。mRNA只占总RNA的1%-2%。 mRNA的分离纯化 分离mRNA用商业化的Oligo dT纤维柱（ Column ） 。 cDNA Synthesis（3）cDNA的合成 4. cDNA文库的大小 一个cDNA文库要包含99%的mRNA时所需要的克隆数目。 p: 文库包含了完整mRNA的概率（99%）1/n:某一种低丰度（不足14份拷贝）mRNA占细胞整个mRNA的比例 N：所需的重组载体

6、数（克隆数）Genomic DNA vs. cDNA 基因组DNA文库含有某一生物中全部DNA序列，而cDNA文库只包括在特定的组织或细胞类型中已被转录成mRNA的那些基因序列，它的复杂性要比基因组文库低得多。由于不同的细胞类型、发育阶段以及细胞所处的特定状态是由特定基因的表达状态所决定的，因此各自的mRNA的种类就不同，由此产生独特的cDNA文库。 正是由于细胞内的基因在表达的时间上并非统一，具有发育的阶段性和时间性，所以任何一个cDNA文库都不可能包含某一生物的全部编码基因。cDNA文库与基因组文库的主要差别： （1）基因组文库克隆的是任何基因，包括未知功能的DNA序列，cDNA文库克隆的

7、是具有蛋白质产物的结构基因，包括调节基因； （2）基因组文库克隆的是全部遗传信息，不受时空影响，cDNA文库克隆的是不完全的编码DNA序列，因它受发育和调控因子的影响； （3）基因组文库中的编码基因是真实基因，含有内含子和外显子，而cDNA文库克隆的是不含内含子的功能基因。五、目的基因的制取（一） 鸟枪法 是一种由生物基因组提取目的基因的方法，实际上是从基因组文库中筛选出目的基因。这个方法最明显的缺点是，所形成的重组体分子，是一群带有大小不同的插入片段的重组体的混合群体。要想从如此巨大数量的群体（基因组文库）中，筛选出带有目的基因的克隆，显然十分费事，而且还会造成不必要的人力和物力上的浪费。（

8、二）酶促逆转录合成法 此法即先构建cDNA文库，再选用适当方法从cDNA文库中筛选出目的基因。 例如：非洲爪蛙编码核糖体RNA基因（rDNA）和编码5s RNA的5s DNA的分离：提取细胞的基因组DNA，放到CsSO4介质中超速离心，并添加Hg+。由于非洲爪蛙的rDNA 和5s DNA的A+T含量较高，而Hg+能够特异地与A、T结合，从而增大了密度差，使rDNA 和5s DNA很容易地从整体DNA中分离出来。单链酶法： 碱基GC比AT之间稳定性高。当用加热或其他变性试剂处理DNA时，双链上AT配对较多的部位先变成单链，应用单链特异的S1核酸酶切除单链，再经氯化铯超速离心，获得无单链切口的DN

9、A。 例如：海胆的rDNA含较多的G C碱基对，在对海胆细胞的DNA加热处理时，双链DNA上的A=T碱基对部分首先变性，这部分局部地分开成为单链，而G C碱基对较多的部分在这一温度下仍保持其双链状态，用专门作用于单链DNA的S1核酸酶切去单链区段，再进行密度梯度离心，即可分离出海胆的rDNA。（四）化学合成法 DNA合成仪的发明，使人工合成DNA成为一种常规技术。如果已知某基因的核苷酸序列，或者基因产物的氨基酸序列，推导出该多肽编码基因的核苷酸序列，就都可以用化学方法合成该基因的核苷酸片段。人工化学合成法一般合成200bp，如果基因较大，可先合成若干个短DNA片段，再连接成一个长的完整基因。

10、磷酸二脂法和亚磷酸三脂法是DNA自动合成仪广泛采用的两种方法。 为保证DNA合成的定向性和专一性，反应时应将不必反应的基团保护起来，而在每一循环之后，清除多余的单核苷酸，并将未反应的固着核苷酸链封闭起来。（五）PCR扩增法 1. 直接从基因组中扩增 （1）提取基因组DNA作模板 （2）根据目的基因序列设计引物 （3）PCR扩增 适合扩增原核生物基因。 真核生物基因组含有内含子！ 2. 从mRNA中扩增: RT-PCR （1）提取total RNA （2）反转录合成总cDNA作模板 （3）根据目的基因序列设计引物 （4）PCR扩增 适合扩增真核生物基因。 原核生物不易得到mRNA，也不含有polyA尾巴。 问题：将含有外源基因组一个酶切片段的质粒称为一个基因组DNA克隆，各种此类质粒的集合体称之为构建了一个 。将含有一个mRNA的DNA拷贝的克隆称作一个cDNA克隆，源于同一批RNA制备物的克隆群则构建了一个 。cDNA技术是进行真核生物基因克隆的一种通用方