乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药检测课件

1、乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测一、HBV耐药的有关定义二、各种耐药检测技术的评价三、需要重视的几个问题乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药的检测乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐一、HBV耐药的有关定义二、各种耐药检测技术的评价三、需要重视的几个问题乙型肝炎病毒核苷酸类似物耐药检测课件一、HBV耐药的有关定义 病毒学突破（virologic breakthrough） 病毒反跳（viral rebound） 生化学突破（biochemical breakthrough） HBV基因型耐药（genotypic resistance） HBV

2、表型耐药（phenotypic resistance） 临床耐药（clinical resistance） 一、HBV耐药的有关定义 HBV耐药的有关定义 病毒学突破（virologic breakthrough）指在核苷类药物治疗过程中，患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBV DNA水平与最低值相比上升或超过1个log10（10倍）。HBV耐药的有关定义HBV耐药的有关定义 病毒反跳（viral rebound）指核苷类药物治疗过程中患者的血清HBV DNA水平一度被抑制，但在继续治疗中血清HBV DNA升高至2104IU/mL或高于治疗前水平。 HBV耐药的有关定

3、义HBV耐药的有关定义 生化学突破（biochemical breakthrough）指在核苷类药物治疗过程中血清丙氨酸氨基转移酶（ALT）水平一度复常，但在继续治疗中血清ALT水平又再次升高。肝脏生活指标很多，但是在此仅指ALT。HBV耐药的有关定义 HBV耐药的有关定义 HBV基因型耐药（genotypic resistance）指HBV基因组中的某些位点发生改变，导致这种药物对HBV的抑制作用下降或消失。这种HBV基因变异与HBV的耐药性有直接因果关系，通过这些变异位点的检测可判断HBV有无耐药性。 HBV耐药的有关定义HBV耐药的有关定义 HBV表型耐药（phenotypic resi

4、stance）通过体外细胞培养方法，直接测定HBV对某种药物的敏感性，或者在体外直接测定HBV聚合酶的活性，敏感性的降低或酶活性的下降均表明有耐药，即表型耐药。通常以IC50来评估 IC505倍:敏感 IC50在510倍:部分耐药 IC50 10倍:耐药HBV耐药的有关定义 HBV表型耐药（phenotyHBV耐药的有关定义 临床耐药（clinical resistance）指临床出现病毒复制不能被抑制，或HBV复制一度被抑制后又出现HBV DNA反跳，同时伴有ALT升高，或肝炎复发的其他临床证据。 HBV耐药的有关定义二、各种耐药检测技术及评价病毒学反跳或突破的监测HBV基因型耐药监测HBV

5、表型耐药检测临床耐药监测二、各种耐药检测技术及评价病毒学反跳或突破的监测基于对血清HBV DNA载量的动态监测需重视以下三点： 1. HBV DNA载量检测手段的敏感性 2.检测技术的可靠性和稳定性 3.监测的间隔时间病毒学反跳或突破的监测HBV基因型耐药监测时机非必须不主张常规、广泛应用HBV基因型耐药监测基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异的命名基因型耐药相关变异在HBV多聚酶序列中的位置基因型耐药相关变异在HBV多聚酶序列中的位置HBV基因型耐药的主要技术碱基序列分析法 直接测序 克隆测序聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP)反向杂交分析技术（INNOLiPA

6、）基因芯片技术 实时荧光定量PCR技术 探针定点突变PCR技术 引物末端碱基定点突变扩增技术 熔解曲线法 基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)HBV基因型耐药的主要技术碱基序列分析法直接测序法末端终止法化学裂解法DNA测序自动化使用特异性引物与单链模板DNA退火，在DNA聚合酶作用下进行延伸反应，用ddNTP终止，用PAGE区分长度仅相差1个核苷酸的ssDNA，从而完成测序的方法。用化学试剂在A、G、C、T处特定的裂解DNA片段，产生一簇各种长度的短链，经过PAGE放射自显影可直读DNA顺序。类似末端终止法，所不同的是用荧光染料标记，计算机自动读出。优点简便、迅速、应用

7、广泛。不需酶促反应，可以对寡核苷酸测序。简便、快速、准确可靠。安全、无放射性污染。模板用量大大减少。测序能力增强。 直接测序法末端终止法化学裂解法DNA测序自动化使用特异性引物HBV YMDD变异直接测序结果图谱HBV YMDD变异直接测序结果图谱直接DNA测序的局限性1. 设备贵、技术高、耗材、费时。2.必须有充足目的基因片段。3.突变株比例小于20%时，由于竞争抑制作用不能被扩增。直接测序法检测HBV YMDD变异1.JPG直接DNA测序的局限性1. 设备贵、技术高、耗材、费时。克隆测序法克隆测序法克隆测序法优点： 1.有助于发现混合株并可大致确定不同序列毒株 之间的相对比。 2.提高了检

8、测的灵敏度。局限性： 1.技术难度较高。 2.检测周期更长。 3.检测的费用大大增加。克隆测序法优点： 碱基变异可能导致： 原有位点消失 产生新的位点 识别位点移位 利用错配引物使 PCR产物中产生 特异的酶切位点结果: 酶切片段长、短变化和多、少变化聚合酶链式反应及限制性片段长度多态性技术(PCR-RFLP) 碱基变异可能导致：结果: 酶切片段长、短变化和多限制性内切核酸酶的作用它们能识别DNA的特异序列，并在识别序列内或其旁切割双链DNA。如：Nde I限制酶的识别序列和切割位点：CA TATGGTAT ACNla Ill限制酶的识别序列和切割位点：CATG NNNGTAC NNN限制性内

9、切核酸酶的作用它们能识别DNA的特异序列，并在识别序PCR-RFLP检测HBV YMDD变异PCR错配引物设计PCR-RFLP检测HBV YMDD变异PCR错配引物设计PCR-RFLP检测HBV YMDD变异PCR-RFLP检测HBV YMDD变异PCR-RFLP检测HBV YMDD变异PCR-RFLP检测HBV YMDD变异PCR-RFLP技术的评价优点： 简单、广泛易开展。缺点： 1.限制性内切酶种类有限。 2.错配引物将导致退火温度降低、非特异条带增多。 3.引物非完全匹配，可能导致扩增效率降低、检测 敏感的下降。 PCR-RFLP技术的评价优点：反向杂交分析技术（INNOLiPA）反向

10、杂交分析技术（INNOLiPA）INNOLiPA诊断HBV YMDD变异INNOLiPA诊断HBV YMDD变异DNA芯片技术BiologicalSampleAnalyze dataScannermicroarray“Hybridize”arrayerMicroarray fabricationSample preparationMolecular hybridizationDetection and analysisDNA芯片技术BiologicalAnalyze dataSDNA芯片技术诊断HBV YMDD变异Detection of YMDD Motif Mutants by Oligo

11、nucleotide Chips in Lamivudine-Untreated Patients with Chronic Hepatitis B Virus Infection。J Korean Med Sci 2004; 19: 541-546.DNA芯片技术诊断HBV YMDD变异Detection oDNA芯片技术 优点 局限性 大通量 技术和设备的要求高 快速 检测成本高 灵敏度高 可平行检测 DNA芯片技术 优点 局实时荧光定量PCR在基因变异中的应用探针定点突变PCR技术Taqman-MGB探针引物末端碱基定点突变扩增技术高分辨熔解曲线法实时荧光定量PCR在基因变异中的应用探针

12、定点突变PCR技术-Taqman-MGB探针定点突变PCR技术Taqman-MGB探针定点突变PCR技术Taqman-MGB探针技术检测YMDD变异HBV DNA105copies/mlW:M=1:1HBV DNA105copies/mlW:M=10:1HBV DNA探针定点突变PCR技术 优点 不足 灵敏度高 需要相对较贵的荧光PCR仪 特异性好 需要多条荧光探针，成本高 费时短 影响因素多，存在一定误判探针定点突变PCR技术引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术引物末端碱基定点突变扩增技术检测YMDD变异引物末端碱基定点突变扩增技术检测YMDD变异熔解曲线法检测YMDD变

13、异特异性探针，其Tm值不同溶解曲线分析熔解曲线法检测YMDD变异特异性探针，其Tm值不同溶解曲线分基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)原理基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALDI-TOF MS)MALDI-TOF MS检测HBV YMDD变异的原理酶切分子量.JPGMALDI-TOF MS检测HBV YMDD变异的原理酶切基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD I-TOF MS)优点： 高灵敏度、准确度、分辨率 能发现相对比例小于1%的变异株。局限性： 设备昂贵，目前国内难以用于临床检测。基质辅助激光解吸电离飞行时间质谱(MALD I-TOF MSHBV耐药不同

14、检测技术的比较Advances in Molecular Diagnosis of HBV Infection and Drug Resistance。Int. J. Med. Sci. 2005 2(1)：8-161Sensitivity here refers to the lowest level (%) at which an assay can detect mixtures of mutant and wild-type virus. 2Information content is considered as a measure of a tests ability to prov

15、ide broad, relevant information about possible new mutations. 3Updateability assesses the ease at which a test can be dapted to incorporate the detection of a new mutation. na, not applicable. nd, not determined.HBV耐药不同检测技术的比较Advances in MoleHBV表型耐药检测有两种途径：1.细胞外HBV聚合酶活性分析。2.细胞药物敏感性实验。HBV表型耐药检测有两种途径：

16、细胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型是将HBV基因组插入杆状病毒载体，继而转染昆虫细胞而表达HBV颗粒，应用亲和层析法纯化HBV颗粒后，在细胞外评价药物对聚合酶活性的影响。细胞外HBV聚合酶活性分析目前常用的研究HBV聚合酶活性模型细胞外HBV聚合酶活性分析细胞外HBV聚合酶活性分析细胞药物敏感性实验该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病毒载体将含有被检测的含HBV变异位点的全基因组导入肝细胞源性细胞株，然后将各种浓度的核苷类药物加入培养液，经过一定时间培养后检测细胞上清中的HBV DNA含量。 细胞药物敏感性实验该方法类似于细菌药物敏感试验。目前多采用病细胞药物敏

17、感性实验细胞药物敏感性实验细胞药物敏感性实验该技术在操作上非常繁琐，目前仅限于研究之需，主要用于药物开发研究，尚不能用于常规临床分析。 细胞药物敏感性实验该技术在操作上非常繁琐，目前仅限于研究之需临床耐药监测YMDD变异前后病毒载量和ALT的变化临床耐药监测YMDD变异前后病毒载量和ALT的变化HBV MDD变异与病毒学突破HBV MDD变异与病毒学突破判断临床耐药时的建议1. 结合核苷类药物的应用史、起始病毒载量、是否合并其他肝病等。2.注意甄别依从性不良。3.结合基因变异位点。 判断临床耐药时的建议1. 结合核苷类药物的应用史、起始病毒载三、需要重视的几个问题慎重对待天然耐药的结论。不要过

18、分依基因型耐药检测技术。正确对待基因分型技术。 三、需要重视的几个问题慎重对待天然耐药的结论。YMDD自然变异的几组数据Akarsu M等采用InnoLipa 法检测71例未经抗病毒的成年慢性乙肝携带者，结果有13例检测到YMDD变异株。Lee CZ等采用引物末端碱基定点突变扩增技术对28例拉米夫定治疗前的CHB患者血清进行了YMDD变异毒株检测，发现有16例（57.1%）存在YMDD自然变异毒株。日本Kobayashi等检测18例无症状HBV携带者,发现5例YMDD变异,占27.78%。YMDD自然变异的几组数据Akarsu M等采用InnoLi本实验室关于YMDD自然变异的2组数据196例CHB患者中，检出存在YMDD变异毒株者共21例，检出率为10.7%。其中YVDD阳性20例，YIDD阳性1例，YVDD和YIDD同时阳性者0例。183例CHB患者中，检出存在YMDD突变毒株者共40例，检出率为21.86%。其中YVDD阳性36例，YIDD阳性