多色流式细胞术监测急性白血病MRD及其临床意义课件

1、多色流式细胞术监测急性白血病MRD及其临床意义 浙江大学医学院附属儿童医院血液肿瘤科 汤永民多色流式细胞术监测急性白血病MRD及其临床意义 浙江大学医学急性白血病初诊时骨髓象ALL AML-M2急性白血病初诊时骨髓象ALL 急性白血病完全缓解（CR）时骨髓象ALL CR原始淋巴细胞：0幼淋巴细胞：2成熟淋巴细胞：6急性白血病完全缓解（CR）时骨髓象ALL CR白血病微小残留病的概念初诊：10101012白血病细胞完全缓解：1010白血病细胞以下微小残留病：1001010完全治愈：理论上0白血病细胞白血病微小残留病的概念初诊：10101012白血病细胞多色流式细胞术监测急性白血病MRD及其临床意

2、义课件白血病细胞动力学及MRD检测101210111010109108107106105104103102101100010-110-210-310-410-510-6初诊或复发可测定MRD的CR病人无法测定MRD的CR病人彻底治愈的病人MRD检测敏感度白血病细胞动力学及MRD检测101210-1初诊或复发可测定MRD的检测方法方法敏感度覆盖面（）骨髓形态学0.10.5x10-1100细胞遗传学10-210-360融合基因10-410-625FCM10-410-590MRD的检测方法方法敏感度覆盖面（）一、FCM检测白血病MRD的基本原理 （一）正常造血及其分化抗原的表达规律一、FCM检测白血

3、病MRD的基本原理 （一）正常造血及其分PLURIPOTENT STEM CELLCD34+CD38-HPP-CFU, LTC-IC,CFU-BLCFU-GEMMCD34+CD38+CD33+CD13+LYMPHOIDSTEM CELLTdT+CD34+BFU-MKCD34+CD61+/-BFU-ECD71+CD36+/- CFU-GMCD34+CD33+CFU-MCFU-G CD19+T PROGENITOR CD7+TOTIPOTENT STEM CELLT4T8CFU-ECD71+CD36+CFU-MKCD61+SELF-RENEWALB CELLB PROGENITORHEMATOPO

4、IESISPLURIPOTENT STEM CELLCFU-GEMML（二）正常细胞分化的阶段特异性和特定的表达顺序及规律（二）正常细胞分化的阶段特异性和特定的表达顺序及规律CD34CD90CD38CD45DRKDRLineage antigensRH123Myeloid lineage differentiationLTC-IC CAFC HPP-CFU CFU-GEMM CFU-GM CD34Lineage antigensRH123MyeloCD 34 CD 7T cell lineage differentiationCD 7CD 71CyCD 3CD 34CD 1aCD 4CD 8C

5、D 7CD 2CD 3CD 3CD 4CD 2CD 5CD 7CD 3CD 8CD 2CD 5CD 7CD 3CD 4CD 2CD 5CD 7CD 38CD 3CD 8CD 2CD 5CD 7CD 38CD34 Stem cellStage I II IIIThymusBMBloodCD 34 T cell lineage differentB cell lineage differentiationCD 34CD34+/-CD 10CD 19CD 20CD 22CyCD 79aCD 10CD 19CD 20CD 21CD 22CD 24CmCD 10CD 20CD 21CD 22CD 24S

6、mIgCD 38CD 20CD 21CD 22 Stem cell Progenitor B Pre-pre-B Pre-B Mature B Plasma cell IgGIgMIgAIgDIgECD 34CD 19CyCD 79aCyCD 22B cell lineage differentiationStem cell CFU-GEMM BFU - E CFU - E Mature RBCCD34CD34CD13CD33CD34CD71CD36GP-ACD71CD36GP-ACD71GP-AErythrocyte Lineage differentiationStem cell CFU-

7、GEMM Stem cell CFU-GEMM BFU - Mk CFU - Mk PlateletsCD34CD34CD13CD33CD34CD41a CD61CD41aCD42CD61CD41aCD42CD61Megakaryocyte lineage differentiationStem cell CFU-GEMM （三）白血病细胞相关性表型(1)血细胞分化成熟过程中正常表达的抗原缺失或表达过度，如B细胞系急性淋巴细胞性白血病(ALL) CD45的表达缺失或T-ALL时CD34、末端脱氧核糖核苷酸转移酶(TdT)的表达过度等；(2)淋和髓系相关抗原共表达，如CD22、CD33的共表达等

8、；(3)不成熟和成熟抗原的非生理性共表达，如CD34、CD56的共表达；(4)细胞表面和细胞浆内抗原同时表达，如T-ALL的细胞膜(m)CD7/细胞浆(c)CD3、B-ALL的mCD19/cCD22等， （三）白血病细胞相关性表型(1)血细胞分化成熟过程中正常表达(四）FCM检测白血病MRD技术问题敏感度：10-410-5，特殊技术状态下可以达到10-6；细胞收集至少10万。单参数：采用白血病特异性标志；7.1 (11q23, MLL基因)，KOR-SA3544 (BCR-ABL) ；多参数：采用多种白血病相关标志的联合应用。(四）FCM检测白血病MRD技术问题敏感度：10-410-二、多参数

9、分析法二、多参数分析法ALL_B细胞系定量组合检测频率（）CD19/CD34/CD10/TdT30-50CD19/CD34/CD10/CD2220-30CD19/CD34/CD10/CD3830-50CD19/CD34/CD10/CD4530-50定性CD19/CD34/CD10/CD1310-20CD19/CD34/CD10/CD155-10CD19/CD34/CD10/CD335-10CD19/CD34/CD10/CD655-10CD19/CD34/CD10/CD215-10CD19/CD34/CD10/CD565-10CD19/CD34/CD10/KORSA354410-20CD19/C

10、D34/CD10/Cy10-20CD19/7.13-5CD19/p533-5ALL_B细胞系定量组合检测频率（）ALL_T细胞系定性组合检测频率(%)TdT/CD390-95CD34/CD330-50ALL_T细胞系定性组合检测频率(%)AML表型组合检测频率(%)CD13/CD33/CD34/CD11b10-15CD13/CD33/CD34/CD6510-20CD13/CD33/CD34/CD1510-20CD13/CD33/CD34/CD5610-15CD13/CD33/CD34/CD3810-15CD33/CD34/CD117/CD1320-40CD33/CD34/CD117/CD152

11、0-40CD33/CD34/CD117/HLA-DR10-15CD33/CD34/CD117/CD11b10-20CD13/CD33/CD34/CD19 5-10CD13/CD33/CD34/CD2 5-10CD13/CD33/CD34/CD710-20AML表型组合检测频率(%)三、免疫学检测MRD的个体化表型组合白血病表型的异质性，个体化现象明显；必须采取个体化设计表型组合的策略；初诊时全面而完整的免疫表型分析的必要性。 三、免疫学检测MRD的个体化表型组合白血病表型的异质性，个体四、FCM监测白血病MRD的意义（一）国外的经验四、FCM监测白血病MRD的意义（一）国外的经验1、Smith

12、 et al. Blood. 2000，96(8): 2691-2696 （小样本）病例及标本：195例儿童ALL，629份标本；检测时间点：诱导治疗结束及维持治疗第14、32、56周。结 果：1、诱导治疗结束时MRD 10-4, 且持续至维持治疗4周，复发率高达6816，如果MRD转阴，复发率为7%7%；2、如MRD持续阳性至32周，高度提示复发的可能，作者经治的所有4例阳性者均复发，而8例转阴性者仅2例复发(P = 0.021)。 1、Smith et al. Blood. 2000，96(Borowitz MJ, et al. Blood, 2008, 111(12): 5477-548

13、5单位：美国COG（Childrens Oncology Group)观察时间：2000年1月-2005年3月病例数：3303例 （大样本）D8： 1946例次D29：2086例次巩固结束：1470例次方法：4色FCM 抗体组合: （1）CD20-FITC/CD10-PE/CD45-PerCP/CD19-APC； （2）CD9-FITC/CD34-PE/CD45-PerCP/CD19-PE。ALL MRD与其他预后因子的关系Borowitz MJ, et al. Blood, 200结 果 5 yrs EFSBorowitz MJ, et al. Blood, 2008, 111(12): 5

14、477-5485结 果 5 yrs EFSBorowitz MJ,不同方案的5 yrs EFSBorowitz MJ, et al. Blood, 2008, 111(12): 5477-5485不同方案的5 yrs EFSBorowitz MJ, et 结 果 早期和晚期复发Borowitz MJ, et al. Blood, 2008, 111(12): 5477-5485结 果 早期和晚期复发Borowitz MJ, etDay 29 结 果Borowitz MJ, et al. Blood, 2008, 111(12): 5477-5485Day 29 结 果Borowitz MJ,

15、et al. Day 8 结 果MRD10%Borowitz MJ, et al. Blood, 2008, 111(12): 5477-5485Day 8 结 果MRDBorowitz MJ, et Day 8 (Day 29 MRD阴性）结 果MRD1%Borowitz MJ, et al. Blood, 2008, 111(12): 5477-5485Day 8 (Day 29 MRD阴性）结 果MRDBoro巩固结束后MRD水平的预后意义Borowitz MJ, et al. Blood, 2008, 111(12): 5477-5485巩固结束后MRD水平的预后意义Borowitz

16、MJ, et结 果Borowitz MJ, et al. Blood, 2008, 111(12): 5477-5485结 果Borowitz MJ, et al. Blood,成人ALL MRD 监测的意义Bassan R, et al. Blood. 2009; 113:4153-4162成人ALL MRD 监测的意义Bassan R, et al 2002年1月至2008年10月期间，我院共收治急性淋巴细胞白血病（ALL）患儿518例，可进行MRD评估的260例，主要的入选标准： （1）根据ALL化疗方案正规治疗1年以上（1年内死亡或复发病例纳入分析）; （2）进行MRD监测至少2次，其

17、中需在诱导化疗第15天或29天进行过MRD监测。研究对象浙江大学儿童医院血液肿瘤科的经验 2002年1月至2008年10月期间，我院共收治急性淋巴研究对象男性 164例，女性96例；1岁:2例；110岁：220例；10岁：38例。低危组：167例；中危组 39例；高危组 54例。c-ALL：172例；Pre-B ALL：21例；Pro-B ALL：8例； T-ALL：34例；伴髓系表达的ALL 25例。研究对象男性 164例，女性96例； 分别在患儿诱导化疗开始后第15天（诱导中期），29天（诱导化疗结束），3月（早期强化结束），6月（半年强化开始），12月（1年强化开始）进行MRD检测，根据

18、患儿初诊时免疫标记情况，采用流式细胞术检测不同的四色单克隆抗体组合。 MRD的检测 分别在患儿诱导化疗开始后第15天（诱导中期）检测MRD的常用组合CD45+CD19+CD34+CD10+：60例（占B系ALL 30.3%）CD45-CD19+CD34+CD10+：95例（占B系ALL 46.8%）CD45+CD19+CD20-CD10+：21例（占B系ALL 10.4%）CD45-CD19+CD20-CD10+：11例（占B系ALL 5.5%）CD45+CD2+CD3-CD56-：18例（占T系ALL 52.9%）检测MRD的常用组合CD45+CD19+CD34+CD10+结 果结 果MRD

19、与治疗反应MRD与治疗反应FCM监测MRD应用举例1：FCM监测MRD应用举例1：FCM监测MRD应用举例1：FCM监测MRD应用举例1：FCM监测MRD应用举例1：FCM监测MRD应用举例1：FCM监测MRD应用举例1：FCM监测MRD应用举例1：Chen N，女，4岁，commonALL, 已CCR 7个月，继续定期化疗中。Chen N，女，4岁，commonALL, 已CCR Wu DQ，女，15岁：VDLD 后 15天，MRD=11646/150000 (7.76）应用举例3：Wu DQ，女，15岁：应用举例3：Wu DQ，女，15岁：VDLD 后 29天，MRD=1797/15000

20、0 (1.20）应用举例5：Wu DQ，女，15岁：应用举例5：Wu DQ，女，15岁：化疗后（VDLD，CAT，HD-MTX 3疗程，VM26+Ara-C x 3 疗程后，出院。2个月后，患儿复发。例5随访结果Wu DQ，女，15岁：例5随访结果存活199例第二肿瘤4例失访14例复发33例（包括2例CNS复发和2例睾丸白血病复发）死亡10例（主要是感染和移植后死亡）1年RFS 95.71.3%， 3年RFS 87.32.4%， 5年RFS 82.33.3% 260例ALL生 存 情 况存活199例260例ALL生 存 情 况260例ALL5年生存情况260例ALL5年生存情况生 存 情 况

21、（3）生 存 情 况 （3）化疗前后MRD实时变化图4. 强化化疗前后MRD实时水平（/105）的变化。化疗前后MRD实时变化图4. 强化化疗前后MRD实时水平（/MRD与治疗反应MRD与治疗反应化疗后第15天MRD水平的预后意义化疗后第15天MRD水平的预后意义化疗后第29天MRD水平的预后意义化疗后第29天MRD水平的预后意义化疗后第3月MRD水平的预后意义化疗后第3月MRD水平的预后意义各时间点MRD水平的预后意义时间点10-4（%）10-410-3（%）10-310-2（%）10-2（%）15天91.64.6（n=123）78.28.0（n=50）74.67.2（n=47）42.316

22、.5（n=22）29天87.55.0（n=148）88.65.4（n=38）66.19.6（n=30）34.217.4（n=17）3月92.23.9（n=132）86.24.9*（n=60）62.89.1*（n=44）6月94.92.7（n=112）80.06.8*（n=55）68.48.5*（n=51）12月95.02.9（n=110）97.22.7（n=42）66.99.9*（n=45）各时间点MRD水平的预后意义时间点10-4（%）10-4危险度病例数10-4（%）10-410-3（%）10-310-2（%）10-2（%）低危15292 ( 60.5%)32( 21.0%)22( 14.

23、4%)6( 3.9%)中危3721( 56.8%)5( 13.5%)8( 21.6%)3( 8.1%)高危5310( 18.9%)13( 24.5%)17( 32.1%)13(24.5%)15天MRD水平与危险度的关系卡方检验：P0.001危险度病例数10-4（%）10-410-3（%）10-3危险度病例数10-4（%）10-410-3（%）10-310-2（%）10-2（%）低危146110 ( 75.3%)18( 12.3%)14( 9.6%)4( 2.7%)中危2613( 50.0%)6( 23.1%)4( 15.4%)3( 11.5%)高危5115( 29.4%)14( 27.5%)1

24、2( 23.5%)10(19.6%)30天MRD水平与危险度的关系卡方检验：P0.001危险度病例数10-4（%）10-410-3（%）10-3可能的危险因素病例数5年RFS比较（%）单因素分析P值多因素分析P值性别（男性）164：9677.14.9 vs. 89.93.90.0650.088年龄（1岁或10岁）40：22083.73.6 vs. 74.68.10.0310.616WBC（100109/L）33：22763.68.2 vs. 86.63.55%）35：22566.710.6 vs. 84.33.50.0300.173危险度（中高危）93：16769.56.0 vs. 89.13

25、.70.0010.142亚型（T细胞型）34：22679.57.6 vs. 83.13.50.0600.14115天MRD水平（10-4）119：12370.95.5 vs. 91.64.60.0010.006预后因素的单因素及多因素分析可能的危险因素病例数5年RFS比较（%）单因素多因素性别（男126例AML, 对CR时骨髓标本进行了MRD检测，根据MRD水平的不同，将该组病例分成4种不同危险度：(1)极低危组(MRD10-4)8例：无1例复发；(2)低危组(MRD在10-410-3)37例：3年复发率为14%；(3)中度危险组(MRD10-2)17例：3年复发率为84%(P = 0.000

26、1)。作者认为：MRD的水平严重影响患者无复发生存率和总生存率(P = 0.003)，是较细胞遗传学改变和获CR所需疗程次数更为重要的预后因子。 2、AML的MRD监测San Miguel et al. Blood. 2001, 98(6): 1746-1751126例AML, 对CR时骨髓标本进行了MRD检测，根据MRAML-MRD的检测及意义单位：德国BFM协作组病人150儿童，542份标本方法：FCM三年存活率有差别，MRD- VS MRD+的3-year-EFS: 71% +/- 6% versus 48% +/- 9%, P(Log-Rank) = .029；MRD-AML-BFM

27、Study Group, Langebrake C, et al. Residual disease monitoring in childhood acute myeloid leukemia by multiparameter flow cytometry: the MRD-AML-BFM Study Group. J Clin Oncol. 2006 Aug 1;24(22):3686-92. AML-MRD的检测及意义单位：德国BFM协作组MRD-AM成人AML-MRD监测的意义Kern W, et al. Cancer 2008; 112:416.成人AML-MRD监测的意义Kern

28、 W, et al. C（二）浙江大学儿童医院血液肿瘤科经验AML：登记采集2002.6 - 2008.9来本院住院治疗的AML病例185例，其中M0 2例，M1 7例，M2 57例，M3 42例，M4 22例，M5 43例， M6 6例， M7 6例。其中可用于MRD评估病例80例，其中M0 1例，M1 3例，M2 28例，M3 27例，M4 7例，M5 12例， M6 1例， M7 1例。病人随访时间：平均随访时间48.1个月（14.078.5个月）。 （二）浙江大学儿童医院血液肿瘤科经验AML：登记采集2002白血病相关免疫表型白血病相关免疫表型AML 13种CD117+CD34+CD33+CD15+CD117+CD34+CD33+CD7+CD117+CD34-CD33+CD15-CD117+CD34-CD33+CD15+CD117+CD34-CD33+CD7+CD117+CD45+CD33+CD15-CD117+CD45+CD34+CD15+CD117+CD45+CD34+CD33-CD117+CD45+CD34+