肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法优质课件

1、肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法提纲化疗药物的发展肿瘤的药物治疗抗肿瘤新药的发现和治疗靶点抗肿瘤药物筛选及评价提纲化疗药物的发展化疗药物的发展近代肿瘤化疗学始于20世纪40年代。50年代通过动物筛选化疗药物发现了5FU、MTX、CTX等，化疗学有了发展。60年代认识到肿瘤细胞动力学及化疗药药代动力学的重要性。大部分目前所用的抗癌药已发现，有急淋、HD、睾丸癌等可化疗治愈。化疗药物的发展近代肿瘤化疗学始于20世纪40年代。70年代形成肿瘤内科学，更多肿瘤有了比较成熟的化疗方案。80年代研究以生物反应修饰剂等药物来提高化疗疗效，探索抗药性产生的原因，5%肿瘤患者

2、可治愈。90年代新抗癌药进入临床，多药耐药基因发现，生物治疗，基因治疗辅助治疗改善等，疗效进一步提高。70年代形成肿瘤内科学，更多肿瘤有了比较成熟的化疗方案。肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法优质课件1、细胞毒类抗肿瘤药2、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物3、肿瘤新生血管生成抑制药物4、肿瘤耐药逆转剂5、分化诱导剂6、基因调节药物7、单克隆抗体药物肿瘤的药物治疗1、细胞毒类抗肿瘤药肿瘤的药物治疗a、拓扑异构酶抑制剂b、胸苷酸合成酶抑制剂c、铂类抗肿瘤药物1、细胞毒类抗肿瘤药a、拓扑异构酶抑制剂1、细胞毒类抗肿瘤药原理： 真核细胞DNA拓扑异构酶（Topo )是生物体内及其重要的细胞核内酶，

3、参与DNA复制、转录和修复等所有关键的核内过程。DNA拓扑异构酶已成为重要的抗肿瘤药物研究新靶点。拓扑异构酶抑制剂已成为高选择性抗肿瘤药物研究的一个主攻方向。 代表药物：喜树碱类化合物 对S期的毒性作用，这一作用需共价TopoIDNA复合物的形成和DNA复制。TopoI抑制剂诱导的细胞凋亡而非DNA断裂是引起细胞最终死亡的原因。a、拓扑异构酶抑制剂原理： a、拓扑异构酶抑制剂原理： 胸苷酸合成酶（TS）把单磷酸脱氧尿嘧啶（DUMP）转换成单磷酸胸腺嘧啶（TMP），在DNA复制和细胞生长过程中起着关键作用。是已知抗肿瘤药物的重要有效靶点之一。胸苷酸合成酶抑制剂导致了DNA断裂从而导致细胞死亡。

4、代表药物：培美曲塞 它是一种结构上含有核心为吡咯嘧啶基团的抗叶酸制剂，通过破坏细胞内叶酸依赖性的正常代谢过程，抑制细胞复制，从而抑制肿瘤的生长。体外研究显示，培美曲塞能够抑制胸苷酸合成酶、二氢叶酸还原酶和甘氨酰核苷酸甲酰转移酶活性，这些酶都是合成叶酸所必需的酶。一旦培美曲塞进入细胞内，它就在叶酰多谷氨合成酶的作用下转化为多谷氨酸的形式。多谷氨酸存留于细胞内成为胸苷酸合成酶和甘氨酰胺核苷酸甲酰转移酶的抑制剂。多谷酸化在肿瘤细胞内呈现时间-浓度性过程，而在正常组织内浓度很底。多谷氨酸化代谢物在肿瘤细胞内的半衰期延长，从而也就延长了药物在肿瘤细胞内的作用时间。b、胸苷酸合成酶抑制剂原理： b、胸苷酸

5、合成酶抑制剂原理： 铂络合物产生抗肿瘤活性的原因，是由于其与肿瘤细胞DNA结合，从而干扰DNA的复制，抑制肿瘤细胞的分裂。代表药物：顺铂和奥沙利铂c、铂类抗肿瘤药物原理： c、铂类抗肿瘤药物a、蛋白酪氨激酶（PTK）抑制剂b、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂C、法尼基转移酶抑制剂2、以细胞信号转导分子为靶点的抗肿瘤药物a、蛋白酪氨激酶（PTK）抑制剂2、以细胞信号转导分子为靶点 原理：通过扩散进入肿瘤细胞，与 EGFR 的胞内段激酶结合区结合，从而抑制 EGFR 受体的磷酸化，阻断受体下游信号通路的传导，发挥抗肿瘤作用。 代表药物：吉非替尼 研究表明吉非替尼的作用通过上调 P27KIP1和 P

6、21CIP/WAF1 的表达，导致细胞 G1 期阻滞或诱导细胞凋亡。 b、表皮生长因子受体酪氨酸激酶抑制剂 原理：通过扩散进入肿瘤细胞，与 EGFR 的胞内段激酶肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法优质课件原理： 法尼基转移酶是近年来发现的与Ras蛋白异戊二烯化修饰密切相关的一种必需酶。抑制法尼基转移酶活性，阻止Ras蛋白的活化，可以有效地抑制肿瘤细胞的增殖 代表药物：替匹法尼c、法尼基转移酶抑制剂原理：c、法尼基转移酶抑制剂原理： 原发肿瘤的生长和转移是依赖于新生血管生成的，开发和研究能够破坏或抑制血管生成、有效地抑制肿瘤生长和转移的药物（称为TA 抑制剂），是新型抗肿瘤药物研究的活跃领域之一

7、。 代表药物：angiostatin和endostatin AvastinEndostatin可直接与血管内皮细胞受体结合抑制内皮细胞的增生； 可与肝素样的硫酸蛋白结合，抑制血管生成； 可抑制VEGF等血管生长因子，从而抑制内皮细胞的增殖 与肿瘤的生长； 可抑制抗凋亡蛋白Bcl-2、Bcl-x1,促使血管内皮细胞凋亡加速。3、肿瘤新生血管生成抑制药物原理：3、肿瘤新生血管生成抑制药物肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法优质课件肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法优质课件原理： 根据肿瘤耐药的特点可分为原药耐药(PDR)和多药耐药(MDR)两大类。前者只对诱导药物产生耐药性而对其它药物不产生交叉耐药

8、性，如抗代谢药甲氨蝶呤(MTX)，5-氟尿嘧啶(5-Fu)等；后者则是指肿瘤细胞一旦对某种化疗药物产生耐药性，同时对其它结构上无关、作用机制各异的药物也产生交叉耐药性，这是一种独特的广谱耐药现象。许多天然来源的抗肿瘤药物如秋水仙碱、紫杉醇等及蒽环类抗癌抗生素如阿霉素、柔红霉素都极易发生MDR。 肿瘤耐药产生的可能原因是药物代谢障碍、DNA修复机制障碍、DNA多聚酶活性改变等。另外，耐药是凋亡抑制的表现。一些与凋亡抑制相关的癌基因(如bcl-2,bcr/abl,NF/KB等)的表达产物可阻断或阻碍多种因素(如化疗药物、辐射、激素等)诱导的肿瘤细胞凋亡，产生耐药性。 研究表明MDR的产生是由于细胞

9、内药物积聚发生障碍，此后研究证实细胞内药物积聚降低的同时，有一分子量约为170 000细胞膜蛋白过度表达，称之为P-糖蛋白(Pgp) 代表药物：钙拮抗药（维拉帕米及其衍生物）、钙调蛋白拮抗药（包括氯丙嗪等吩噻嗪类衍生物）、环孢素类（环孢素及其衍生物PSC833，SDZ280-466等）及抗雌激素类化合物（他莫昔芬）等。4、肿瘤耐药逆转剂原理：4、肿瘤耐药逆转剂EXTRACELLULARINTRACELLULARATPPGP170ATPDrugDrugPlasmaMembraneEXTRACELLULARINTRACELLULARATP 环胞菌素A(CsA)是一种从真菌属中提取的天然药物，具有选

10、择性的免疫抑制功能，广泛用于器官移植后的抗排斥反应及治疗免疫性疾病。它能竞争性的和Pgp结合，阻断Pgp泵出药物的功能，提高胞内药物浓度，从而对抗MDR，通过进一步研究表明，CsA的作用机制并非单一，除了通过结合Pgp而调节药物浓度外，还可通过与细胞内，靶结构之间的相互作用而增加化学敏感因子自身的细胞毒性。CsA在MDR中可调节药物的运输，使抗癌药在细胞内积累增加，外排减少，从而增加抗肿瘤药物的敏感性。 原理： 通过诱导肿瘤细胞凋亡达到肿瘤缩小、消退的目的已成为当今肿瘤治疗的研究热点。促进恶性细胞向成熟分化的抗癌药物称分化诱导剂。代表药物：维A酸类化合物 咪唑衍生物利阿唑5、分化诱导剂原理：5

11、、分化诱导剂 维A酸类化合物维甲酸类化合物(Retinoic acids)在调控细胞生长、分化、凋亡等生命活动中起重要作用。其在体内的生理活性代谢产物包括全反式维甲酸(ATRA)、13-顺维甲酸(13-cis-RA)和9-顺维甲酸(9-cis-RA)，它们可通过核维甲酸受体(RAR)结合于DNA应答元件，从而调节靶基因的转录。 维A酸类化合物维甲酸类化合物(RetinoiRight now we lump patients together and treat them with the same drugs and then deal with their variable response

12、 to treatment. Were essentially treating different diseases with the same medicine.”Richard Klausner, 1997 肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法优质课件a、反义药物b、Decoy核酸C、RNA干扰6、基因治疗a、反义药物6、基因治疗a、反义药物 反义药物又称反义寡核苷酸药物（AODNs） ，是指人工合成长度为1030个碱 基的DNA分子及其类似物。根据核苷酸杂交原理，反义药物能与特定的 基因杂交，在基因水平上干扰致病蛋白质的产生过程。 AODNs 可以与其靶RNA链互补结合，形成RNA-DN

13、A杂交双链。形成的杂交双链可以被RNA酶H识别并消化RNA链，由此释放出的 AODN可以继续与靶RNA链结合，最终导致编码基因沉默。由此可推RNA酶H过多表达可增强各种AODNs效应，反之RNA酶H受抑则降低其作用。有些AODNs 并不能激活RNA酶H，相反与翻译元件竞争空间因此可抑制RNA翻译。另外，AODNs 如果和mRNA结合可作用于内含子外显子接合处以中断其拼接过程。AODNs还可以占领校正RNA细胞内定位的蛋白RNA作用序列，从而扰乱RNA运输， 药物：Vitravenea、反义药物a、反义药物a、反义药物5-ACGCT-33-TGCGA-5mRNARNAse HAntisense

14、DNA5-ACGCT-33-TGCGA-5mRNARNAs Decoy核酸是与靶转录因子具有高亲和性的双链寡聚核酸 ,通过竞争性抑制转录因子与调控区域的结合 ,调控转录来改变下游基因的异常表达 ,从而抑制肿瘤恶性增殖 . 体外筛选结合转录因子AP2的decoy核酸药物 ,结果K102对多种肿瘤细胞生长有显著的抑制作用 ,在异植人肿瘤细胞NCIH460的裸鼠模型中 ,静脉注射高中低三剂量组的decoy核酸K102 ,抑瘤率分别达 71.8%、64.4 %及 57.3%.通过凝胶阻抑试验 ,验证了K102与转录因子产生特异性结合 .实验结果为decoy核酸转录调控药物的研究提供了依据。b、Deco

15、y核酸 Decoy核酸是与靶转录因子具有高亲和性的双链寡聚核酸Design oligos which can specifically bind to the transcription factor JUN/ATF and block downstrean multiple oncogenes expressionDesign oligos which can specif RNA干扰(RNAinterference，RNAi)是由双链RNA(double-stranded RNA，dsRNA)引发的转录后基因静默机制. RNAi是真核生物中普遍存在的抵抗病毒入侵、抑制转座子活动、调控基因表

16、达的监控机制。由于RNA干扰是针对转录后阶段的基因沉默，相对于传统基因治疗对基因水平上的敲除，整个流程设计更简便，且作用迅速，效果明显，为基因治疗开辟了新的途径。其总体思路是通过加强关键基因的RNAi机制，控制疾病中出现异常的蛋白合成进程或外源致病核酸的复制及表达。c、RNA干扰 RNA干扰(RNAinterference，RNA 单克隆抗体(单抗)药物就是通过淋巴细胞杂交瘤技术或基因工程技术制备的抗体。起初用于诊断剂或检测剂，后来用于治疗肿瘤、病毒性感染、心血管病以及其它疾病。治疗肿瘤的优越性： （1）单抗药物对肿瘤细胞的选择性杀伤作用 （2）单抗药物具有更高的疗效 （3）单抗药物对肿瘤相关

17、靶点的特异性作用 其研究重点主要集中在将抗体与化学药物、酶、放射性核素、毒素和生物诱导剂等耦联后直接杀伤肿瘤或者利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。目前，国际上与肿瘤治疗相关的抗体研究主要集中在将抗体与耦联物作用后直接杀伤肿瘤细胞，利用抗体促进肿瘤细胞凋亡和抑制肿瘤血管生成等方面。7、单克隆抗体药物 单克隆抗体(单抗)药物就是通过淋巴细胞杂交瘤技术或肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法优质课件 代表药物：曲妥珠单抗（trastuzumab， Herceptin ） Trastuzumab为靶向结合HER2的人IgG1类单抗，HER2为酪氨酸激酶受体，在约20%25%的进展期乳腺癌患

18、者过表达。HER2分子具有以下的特点，因此成为乳腺癌治疗的靶分子： HER2的表达水平与乳腺癌的发病机理及预后相关； 肿瘤的HER2表达水平及基因拷贝数远高于正常组织，有效的减轻了HER2靶向治疗药物的毒性； HER2表达阳性的肿瘤细胞比例很高，而且在肿瘤细胞表面高表达，因此在患者体内可以靶向大多数的肿瘤细胞； HER2在原发肿瘤及转移灶均有表达，因此HER2靶向治疗对原发及转移病灶均有效。 代表药物：曲妥珠单抗（trastuzumab， Herc曲妥珠单抗（trastuzumab）的作用机制：抑制受体信号传导。HER2可以活化多种信号传导通路，包括PI3K、MAPK等。Trastuzumab

19、减少了这些信号通路的传导，将细胞阻滞于调定点，诱导细胞凋亡。受体信号传导的降低是由于trastuzumab介导的HER2受体内化及降解。通过调节p27kipl阻滞细胞于G1调定点。Trastuzumab处理的细胞被阻滞于G1调定点，细胞增殖减少。细胞阻滞于G1调定点与细胞周期依赖的激酶抑制蛋白p27kipl相关。诱导细胞凋亡。体内研究表明trastuzumab可以诱导乳腺癌细胞凋亡，凋亡的发生与Ki67的表达无关。抑制血管形成。高表达HER2的肿瘤细胞新生血管及VEGF的表达显著增加。体内研究结果显示trastuzumab处理后，乳腺癌肿瘤体积减小，微血管密度降低；体外研究表明trastuzu

20、mab处理后，内皮细胞的迁移能力下降。 抑制DNA修复。体外研究显示可与许多化疗药物产生协同效应。Trastuzumab或联合化疗药物促进DNA损伤，并抑制DNA的修复，最终导致细胞凋亡。曲妥珠单抗（trastuzumab）的作用机制：肿瘤动物模型和抗肿瘤药物的研究方法优质课件抗肿瘤新药发现抗肿瘤新药发现Mathematical modelCell BiologyTarget selectionDrug design(Pre)clinical testingMathematical Cell BiologyTargeHow many drug targets are there?8,000 t

21、argets of pharmacological interest, of which nearly 5,000 could be potentially hit by traditional drug substances, nearly 2,400 by antibodies and 800 by protein pharmaceuticals. How many drug targets are therDrug Target: EnzymesDrug Target: EnzymesDrug Target: Enzymes IIDrug Target: Enzymes IIDrug T

22、arget: Enzymes IIIDrug Target: Enzymes IIIDrug Target: Enzymes IIIDrug Target: Enzymes IIIDrug Target: Receptors IDrug Target: Receptors IDrug Target: Receptors IIDrug Target: Receptors IIDrug Target: Receptors IIIDrug Target: Receptors IIIDrug Target: Receptors IIIDrug Target: Receptors IIIDrug Tar

23、get: Ion channelsDrug Target: Ion channelsDrug Target: Transport proteinsDrug Target: Transport proteinDrug Target: DNA/RNA and the ribosomeDrug Target: DNA/RNA and the rDrug Target: Targets of monoclonal antibodiesDrug Target: Targets of monoclDrug Target: Various physicochemical mechanismsDrug Tar

24、get: Various physicoch抗肿瘤药物的筛选和评价抗肿瘤药的临床前药理研究包括药效学和毒性研究两部分抗肿瘤药物药效学需研究内容：体外抗肿瘤试验体内抗肿瘤试验评价药物的抗癌活性时，以体内试验结果为主，同时参考体外试验结果以做出正确的结论。 抗肿瘤药物的筛选和评价抗肿瘤药的临床前药理研究包括药效学和毒体外抗肿瘤活性试验 目的：对候选化合物进行初步筛选； 了解候选化合物的抗瘤谱；为随后进行的体内抗肿瘤试验提供参考，如剂量范围、肿瘤类别等 。 体外抗肿瘤活性试验 目的：体外抗肿瘤活性试验常用方法体外试验常用方法有：染料排斥法四氮唑盐还原法 阿拉马蓝法磺酰罗丹明染色法 集落形成法生长曲线

25、测定法。药物与细胞共培养时间一般为48-72 小时，贴壁细胞需先贴壁24 小时后再给药。试验应设阳性及阴性对照组，阳性对照用一定浓度的标准抗肿瘤药，阴性对照为溶媒对照 体外抗肿瘤活性试验常用方法体外试验常用方法有：体外抗肿瘤活性试验常用方法染料排斥法（dye exclusion assay）试验原理：活细胞有排斥某些染料如伊红、台盼蓝、苯胺黑等的能力，而死细胞由于膜完整性的破坏，可被着色。因此培养的肿瘤细胞中加入这些染料，一定时间后，对着色和未着色的细胞进行计数，即可算出被杀死的细胞比例。方法要点：向一定容积的待检细胞悬液加入定量的某种染液，最常用的是0.4%台盼蓝液，混匀，室温染色5-15m

26、in，将已染色的细胞悬液滴加至血细胞计数板，直接在光镜下计数活细胞数和细胞总数。观测指标：按（未染色细胞数/细胞总数）X100%计算活细胞率，对照组活细胞率应在90%以上。根据活细胞率计算受试样品的半数致死剂量（IC50）作为药物抗肿瘤活性的指标。体外抗肿瘤活性试验常用方法染料排斥法（dye exclusi体外抗肿瘤活性试验常用方法阿拉马蓝法（alamar blue assay）试验原理：非荧光性蓝色底物阿拉马蓝可被活细胞中的线粒体内的NADPH相关的脱氢酶类还原为强荧光性粉红色底物，采用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值，与活细胞数呈良好的线性关系

27、。方法要点：细胞经受试样品处理后，加入10-20ul阿拉马蓝染液，继续培养一定时间，用微培养板自动读数仪在激发与发射波长分别为530nm和590nm处读取荧光强度值。观测指标：根据荧光强度可以计算细胞生长抑制率，适当时可进一步计算IC50值。体外抗肿瘤活性试验常用方法阿拉马蓝法（alamar blue体外抗肿瘤活性试验常用方法集落形成法（clonogenic assay）试验原理：克隆原细胞具有持续增殖能力，当单个细胞分裂6代或6代以上时，其后代所组成的群体(集落)便含50个以上细胞。通过集落计数可对克隆原细胞作定量分析。它反映了单个细胞的增殖潜力，故能较灵敏地测定抗癌药的活性，日前被认为是一

28、种较理想的检测方法。方法要点：将浓度为500个细胞/ml的对数生长期细胞悬液2ml种至35ml的培养皿，并加受试样品适量，培养7d或更长时间，姬姆萨染色，解剖显微镜下计数含50细胞以上的集落。观测指标：根据集落数计算集落形成率，对照组集落形成率不应低于40%，再计算用药组的集落形成抑制率，根据情况可进一步采用Logit法计算受试样品的IC50值。 集落形成率=集落数/细胞接种数X100% 集落形成抑制率=（1-用药组集落形成率）/对照组集落形成率X100%体外抗肿瘤活性试验常用方法集落形成法（clonogenic 体外抗肿瘤活性试验常用方法生长曲线测定法（growth-curve determ

29、ination）试验原理：在最适条件下，肿瘤细胞在培养液中呈指数生长，如取细胞数的对数与培养时间作图可得一条直线，故称此时为对数生长期。随着细胞密度不断增高，由于代谢产物的积聚及营养物的消耗，细胞生长逐渐减慢以致停止，此时称高坪期或稳定期。因此药物对细胞生长的影响可通过生长曲线反映出来 。方法要点： 将浓度为10000个细胞/ml的对数生长期细胞悬液按每瓶5ml种至25ml的培养瓶，或按每孔100微升种至96孔板，并加受试样品适量，培养后分别于即刻和1、2、3、4、5、6、7d进行检测。前者可采用台盼蓝染色计数活细胞，后者可采用MTT法或SRB法读取OD值，并据此进行作图与计算。 观测指标 1

30、、倍增时间(TD),将实际生在曲线进行直线回归求出0和t时刻的理论细胞数N0和N t，据此计算：TD=0.301t/（log N tlog N0）；2 增殖细胞杀伤率（%）=( N0N0)/ N0100%；3 细胞生长饱和密度（N s），代表高坪期每毫升细胞数的均数。 体外抗肿瘤活性试验常用方法生长曲线测定法（growth-cu体外抗肿瘤活性试验常用方法磺酰罗丹明染色法（sulforhodamine B assay）试验原理：SRB是一种蛋白质结合染料，粉红色，可溶于水。 SRB可与生物大分子中的碱性氨基酸结合。其在515 nm波长的OD读数与细胞数呈良好的线性关系。故可用作细胞数的定量。MT

31、T法的一个缺点是OD值可随放置时间而变，而SRB法无此现象。因此更适用于进行大规模的试验。 方法要点： 用10%冷三氯乙酸与4固定已经受试样品处理的细胞1h，洗涤，干燥；加入4mg/ml SRB液100微升/孔 染色15min，1%冰醋酸洗涤，干燥；最后加入150微升/孔 的Tris溶液，在酶标仪上与515nm波长处检测OD值。观测指标 同MTT法。另外，NCI目前采用以下指标评价化合物的体外抗肿瘤活性。测定的OD值包括对照组、加药组及加药时的细胞的OD值C、T、和T0。据此计算： 生长抑制率（%）=（TT0）/（CT0）100% ；细胞死亡率（%）=（TT0）/ T0 100% 。 按生长抑

32、制率或细胞死亡率对样品浓度绘出量效关系曲线图，并求出： GI50，即生长抑制率为50%时的样品浓度； TGI，即生长抑制率为100%时的样品浓度： LC50，即细胞死亡率为50%时的样品浓度。体外抗肿瘤活性试验常用方法磺酰罗丹明染色法（sulforho体外抗肿瘤活性试验常用方法四氮唑盐还原法（tetrazolinm salt reduction assay）试验原理：四氮唑MTT,3-(4,5-dimethylibiazol-2-yl)-2,5-diphenyl-tetrazolium bromide是一种能接受氢原子的染料。活细胞线粒体中与NADP相关的脱氢酶在细胞内可将黄色的MTT转化成不

33、溶性的蓝紫色的甲月替 (formazan)，而死的细胞则无此功能。用二甲基亚讽(DMSO)溶解甲月替后，在一定波长下用酶标仪测定光密度值，即可定量测出细胞的存活率。 方法要点：受试样品处理细胞结束后，加入5mg/ml MTT液20微升/孔，继续培养四小时。再加三联液并培养过夜。在酶标仪上于570nm波长处检测OD值。 观测指标 直接指标为96孔板上各被测孔的OD值；然后按公式（对照组OD值-治疗组OD值）/对照组OD值100%计算出相应的细胞生长抑制率；剧情况可进一步采用Logit法计算50%生长抑制浓度IC50值。 体外抗肿瘤活性试验常用方法四氮唑盐还原法（tetrazoli体外抗肿瘤活性试

34、验体外筛选方法的优点：操作简单用药量少取材可直接用于人体肿瘤得出结果快速体外抗肿瘤活性试验体外筛选方法的优点：Case: Activity of 20 compounds on the growth of three cancer cell linesProvider: C Biotech CompanyCase: Activity of 20 compoundsHuman NCI-H460 lung cancer cell without treatmentHuman NCI-H460 lung cancer cell With Compound A treatmentHuman NCI-H

35、460 lung cancer Hum体外抗肿瘤活性试验 体外筛选方法的缺陷：1、细胞毒性易显阳性，有毒物质也常常显阳性，故假阳性率高2、非直接对肿瘤细胞作用的药物显示假阴性3、体外细胞并不能完全代表体内肿瘤的恶性细胞体外抗肿瘤活性试验 体外筛选方法的缺陷：体内抗肿瘤活性试验 1、自发性肿瘤2、诱发的肿瘤3、移植性肿瘤 （a）皮下肿瘤模型 （b）腹水瘤模型 （c）原位接种模型 体内抗肿瘤活性试验 1、自发性肿瘤65第一节 自发性肿瘤动物模型(animal model of spontaneous tumors)概念: 未经人为处理；自然发生 自发性乳腺癌模型 自发性白血病模型65第一节 自发性

36、肿瘤动物模型(animal model66 一、自发性乳腺癌模型 生长在体表,易早期发现,罕有自发消退,因而能准确观察其大小与生长速度,便于进行实验。66 一、自发性乳腺癌模型 生长在体表,易67 现介绍三种自发性乳腺癌小鼠模型C3H小鼠：繁殖用雌鼠自发性乳腺癌发生率为 85%100%。 A系小鼠： 经产雌鼠乳腺肿瘤发生率为30%80%。 CBA小鼠：雌鼠自发性乳腺癌发生率为60%65%。 67 现介绍三种自发性乳腺癌小鼠模型C3H小鼠68 在乳腺左右两侧及乳头部均可发生肿瘤。每只小鼠常见1个以上肿瘤。选择肿瘤数目和大小相近的动物, 配对分组,给予受试药,观察受试药对肿瘤发展的影响。 给药方案

37、和给药途径可根据受试药物的特点确定。因自发性乳腺癌发展较缓慢，故采用间歇给药或小剂量连续给药较为合适。 68 在乳腺左右两侧及乳头部均可发生肿瘤。每只小鼠常见169结果判定 给药后每天观察肿瘤生长情况，记录发生时间和位置。 肿瘤结节长到一定程度,每周用脚规测量皮下肿瘤2次。测定肿块的最大径(a)和最小径(b)。 肿瘤体积(cm3) = ab2/269结果判定 给药后每天观察肿瘤生长情况，记录发生时间70 将肿瘤体积变化对时间作出生长曲线,可由曲线的斜率变化判断药物抑制肿瘤生长的作用,尤其应观察肿瘤能否完全消退。70 将肿瘤体积变化对时间作出生长曲线,可由曲线的斜率变71注意事项1.在同一品系内

38、,发病率比较稳定,而不同品系间差别甚大。 2.动物乳腺癌发生与遗传基因、乳癌因子(即致乳癌病毒)及激素有关。 3.饲料的变更有明显影响,要用固定全价营养饲料。 4.配对分组。71注意事项 3.饲料的变更有明显影响,要用固定全价营72 二、AKR白血病模型 AKR小鼠为白血病高发品系，淋巴细胞白血病发病率雄性76%90%，雌性为68%90%。 操作步骤 实验用612月龄AKR小鼠, 此时鼠的脾和淋巴结肿大, 血象异常。 经血液检查确诊为白血病后的次日, 配对分组并开始给予受试药, 观察结果。 72 二、AKR白血病模型 AKR小鼠为白血病高发品系73 观察指标：末梢血象,白细胞数,淋巴结和脾大小

39、,动物生存时间。有效者生存期比对照组延长, 并根据血象评价药物的诱导缓解和维持缓解作用。 各鼠白血病的病程不一,自发瘤确诊后, 实验时应配对分组。 结果判定 注意事项73 观察指标：末梢血象,白细胞数,淋巴结和脾大小,动物生存74自发性肿瘤的总体评价 动物自发性肿瘤的病因往往是由动物的遗传特性决定的,与人癌的病因有较大距离。 各动物肿瘤生长速度差异较大, 很难在限定时间内获得大量生长均匀的荷瘤动物(tumor-bearing animals) 因此，自发性肿瘤动物模型很少在抗肿瘤药物的常规筛选中广泛应用。74自发性肿瘤的总体评价 动物自发性肿瘤的病因往往是由75第二节 诱发性肿瘤动物模型(an

40、imal models of induced tumor)概念: 在实验条件下; 使用致癌物(carcinogens); 诱发动物发生肿瘤75第二节 诱发性肿瘤动物模型(animal model76 基本原理 利用外源性致癌物引起细胞遗传特性改变，从而出现异常生长和高增殖活性细胞,形成肿瘤。 外源性致癌物主要有化学性、物理性(如放射性物质)及生物性(如诱发动物肿瘤的病毒),其中以化学性致癌物最为常用。76 基本原理 利用外源性致癌物引起细胞遗传特性改77 一、诱发性肿瘤动物模型的基本方法 实验时,必需注意选择合适的致癌方法、动物种系、致癌物及其溶剂、给予剂量、途径以及观察时间等。致癌物的剂量应

41、能保证动物的存活率较高、诱发期较短和诱发肿瘤频率较高。77 一、诱发性肿瘤动物模型的基本方法 实验时,78常用的致癌物给予方法和途径 1.涂抹法: 涂抹在背部及耳部皮肤,主要用于诱发皮肤肿瘤。 2.经口给药法：通过饮水、饲料或灌喂动物。常用于食道癌、胃癌及大肠癌等。 3.注射法：致癌物制成溶液,经皮下、肌内、静脉或体腔等途径注入体内,本法较常用。78常用的致癌物给予方法和途径 1.涂抹法: 涂抹在背部及79常用的致癌物给予方法和途径 4.气管注入法：常用于诱发肺癌。 5.穿线法：将致癌物置于无菌试管内,加热使之液化,吸附于预制的线结上,再将此线结穿入靶组织而诱发肿瘤。 6.埋藏法：包埋于皮下或

42、其他组织内。79常用的致癌物给予方法和途径 4.气管注入法：常用于诱发80二、诱发性肿瘤模型的动物和致癌物动物：大鼠，小鼠，犬等致癌物：多环碳氢类亚硝胺类偶氮类黄曲霉毒素 （饲料中含0.0010.015ppm黄曲霉毒素B1, 喂养6个月,诱发大鼠肝癌）。 ppm = parts per million80二、诱发性肿瘤模型的动物和致癌物动物：大鼠，小鼠，犬等818182 诱发性肿瘤模型的总体评价 约80%人癌是由环境因素引起的, 诱发性肿瘤的病因与人癌的情况近似, 且均经过较长演变过程而成瘤。动物诱发性肿瘤是比较类似于人类肿瘤的动物模型。 然而,人癌的发生原因十分复杂,往往并非由已知的动物致癌

43、物所引起。另外,动物诱发性肿瘤的组织病理类型、发生发展过程也不一定与人癌完全一致。 82 诱发性肿瘤模型的总体评价 约80%人癌是83 本模型的最大困难是诱癌时间长、成癌率常达不到100%, 而且动物之间肿瘤发生时间、发展速度的个体差异很大, 难以将未治疗的动物作为治疗动物的对照。83 本模型的最大困难是诱癌时间长、成癌率常达不到10084第三节移植性肿瘤动物模型(Animal model of transplanting tumors)84第三节85 移植性肿瘤动物模型是指将动物或人体肿瘤移植到同种或异种动物体内连续传代而形成的肿瘤。 该实验法是抗肿瘤药物筛选最常用的体内方法，具有重要作用。

44、目前临床上常用的抗肿瘤药大多是首先经该实验法而被发现的。85 移植性肿瘤动物模型是指将动物或人体肿瘤移植到同种或86 一般给予试验药710d, 在第811d可解剖动物获得结果。通过一些指标的观察, 可以判断试验药是否有具有抑制肿瘤生长的作用。这是任何体外试验所不能替代的, 其结果可为抗癌药物疗效提供重要依据。86 一般给予试验药710d, 在第811d可解剖动87 它比前述的自发性和诱发性动物肿瘤更易实施。 现有移植性肿瘤接种成功率可达100%, 可在同一时间内获得大量(数十至百余只动物)、生长相当均匀的肿瘤。87 它比前述的自发性和诱发性动物肿瘤更易实施。 现88 移植性肿瘤常用的动物为小鼠

45、、大鼠和地鼠。研究药物的抗肿瘤作用可选择三种或三种以上小鼠、大鼠的移植性肿瘤进行实验治疗；抗肿瘤药物筛选时，每批动物的来源应一致；一、动物的选择88 移植性肿瘤常用的动物为小鼠、大鼠和地鼠。研究药物的89 根据瘤株的特点选用近交系、远交系或F1动物；雌雄性动物均可应用(乳腺癌等必须用雌性动物)。 每批实验只用同一性别动物。 小鼠体重1822g，大鼠体重5070g 每组至少10只动物，裸鼠可用510只。89 根据瘤株的特点选用近交系、远交系或F1动物；雌雄性动90二、肿瘤细胞的选择 复制移植性肿瘤模型需要使用肿瘤细胞株(瘤株，tumor strain)或细胞系(cell line)。 细胞株(c

46、ell strain)是指通过选择法或克隆法从原代培养物或细胞系中获得的具有特殊遗传、生化性质或特异标记的细胞群。90二、肿瘤细胞的选择 复制移植性肿瘤模型需要使用肿瘤细91 瘤株的组织学类型和生长特征趋于稳定，并能在同系、同种或异种动物体内移植并连续传代。 生长特征，包括接种成活率、生长速度、自动消退率、宿主寿命与宿主反应等。 细胞系：原代培养物经首次传代成功后即为细胞系，由原先存在于原代培养物中的细胞世系所组成。 91 瘤株的组织学类型和生长特征趋于稳定，并能在同系92 目前，动物移植性实验肿瘤（包括实体瘤、腹水瘤和白血病）约500种，还有大量人的瘤株或细胞系。常用的动物移植性肿瘤瘤株或细

47、胞系有： 92 目前，动物移植性实验肿瘤（包括实体瘤、腹水瘤和白血93肉瘤S180腹水型或实体型艾氏腹水癌或实体型肝癌腹水型（HepA）或实体型（H22） 小鼠白血病L1210、P388及L615小鼠黑色素瘤（B16） 小鼠Lewis肺癌 肉瘤S37结肠癌C38、结肠癌C26 子宫颈癌（U14）大鼠Walker癌肉瘤256（W256）93肉瘤S180腹水型或实体型艾氏腹水癌或实体型肝癌腹水94 筛选抗癌药物时，最好选用3类瘤株，即肉瘤、腹水型肿瘤和白血病株。在众多移植性肿瘤中，目前最受重视和应用最广的是： 小鼠Lewis肺癌 小鼠黑色素瘤B16 小鼠白血病P388 瘤株或细胞系的选择应尽量考虑

48、与临床拟研究肿瘤的性质、部位等相近，如拟研究肝癌的治疗，可首选肝癌瘤株。 94 筛选抗癌药物时，最好选用3类瘤株，即肉瘤、腹水型肿95 一种药物不一定对各种类型移植性肿瘤都有效，如果仅选一种瘤株进行药物筛选就可能出现漏筛。 还必须指出，动物肿瘤的生物学特点与人类肿瘤有较大差别，对动物肿瘤生长有抑制作用的药物对人类肿瘤未必有效。95 一种药物不一定对各种类型移植性肿瘤都有效，如果96三、接种方法 (一)一般要求 整个操作应在无菌条件下进行，可在无菌室和超净工作台内操作。动物处死后消毒皮肤，对每个实体瘤应分别使用灭菌的外科器械切取，对腹水瘤则应分别用灭菌的注射器抽吸。 96三、接种方法 (一)一般

49、要求97接种方法 瘤块污染常是接种失败的主要原因，应特别注意!在高温季节操作时，可在盛有瘤源的器皿周围放置冰块直接降温。 常用接种部位： 实体瘤_腋窝皮下 肌肉接种_大腿肌肉 腹水型肿瘤_腹腔 97接种方法 瘤块污染常是接种失败的主要原因，应特别注意98(二)接种操作1.实体瘤 (1)基本过程（以实体瘤为例）冻存的瘤株-移入宿主体内（瘤源动物）-7-10 d(增殖)获得瘤块-制备瘤块-给动物接种(受体动物)98(二)接种操作(1)基本过程（以实体瘤为例）冻存的瘤株-99 (2)瘤块接种法：选取接种后710d生长状态良好的瘤源动物，颈椎脱臼处死，消毒操作部位皮肤。切开皮肤，剥离出瘤块，置于平皿上

50、,平皿应放置在冰块上,内置少许灭菌的PBS或其他营养液,剔除非肿瘤组织和坏死组织，选取生长良好而无变性坏死、淡红色、鱼肉状的瘤组织，在无菌平皿内剪成2mm3的小块。 黑色素瘤则呈黑色或黑紫色 注意不用瘤中央的坏死部分99 (2)瘤块接种法：选取接种后710d生长状态良好100瘤源动物-颈椎脱臼处死-消毒切开皮肤-取瘤剪成 2mm3 小块-用套管针抽吸瘤块接种于受体动物右前肢腋窝皮下 缩短接种操作时间,从瘤块取材到接种完毕一般应在30min内；平皿内放置少许灭菌PBS或其他营养液；接种部位皮肤应先消毒。流程图：100瘤源动物-颈椎脱臼处死-消毒切开皮101 (3)瘤细胞悬液接种法 如每次需要接种

51、的动物数量较多时，可用瘤细胞悬液接种:取几个瘤块-除去坏死部分-混合瘤块-剪成小块-匀浆器单向研匀-放入无菌容器-生理盐水稀释成1:31:4悬液 每只动物接种0.2ml；整个操作应在30min内完成；每次抽吸前应将细胞混匀。101 (3)瘤细胞悬液接种法 取几个瘤块-除去坏102 (4)培养细胞接种法： 对数生长细胞胰酶消化PBS洗涤2次计数活细胞数用生理盐水稀释成细胞悬液细胞悬液置于冰上注射到接种部位(0.2ml,含11061107个细胞)。 102 (4)培养细胞接种法：103 2. 腹水型肿瘤 (1)抽取腹水：选择接种后710 d 的健康动物颈椎脱臼处死-腹部皮肤消毒-剪开剥去腹部皮肤-

52、抽吸腹水-放入无菌容器内-若用几只动物作为瘤源动物时,应将腹水混合.103 2. 腹水型肿瘤选择接种后710 d 的健康动物颈104104105 另取小量腹水,置于加有肝素的干试管内,作为观察细胞形态及细胞计数用。 将空针中剩余的腹水制备推片,瑞氏染色,镜下进行细胞分类计数,其中瘤细胞数应95%。 抽出的腹水应为乳白色浓稠液体,若为黄色或含有大量红细胞时应弃去。105 另取小量腹水,置于加有肝素的干试管内,作为观察细106 (2)细胞计数： 取肝素管内的瘤细胞,用生理盐水稀释10倍;取稀释液0.9ml,加0.2%台盼蓝生理盐水溶液0.1ml混匀。用血细胞计数法计数瘤细胞总数和死细胞数。 瘤细胞

53、死亡后，细胞膜通透性发生改变，细胞可被台盼蓝染成蓝色, 而活细胞不着色。106 (2)细胞计数： 取肝素管内的瘤细胞,用生理盐107107108 计数计数板四角大方格内的细胞数, 计数时对压边线的细胞,计左不计右,计上不计下。计数四个大方格内的细胞总数,然后按下列公式计算总细胞数和活细胞总数。 四大方格细胞总数死细胞数活细胞数/ml悬液 稀释倍数10000 4 108 计数计数板四角大方格内的细胞数, 计数时对压边线109 (3) 接种： 腹水用含葡萄糖的无菌Hanks液稀释至适当的浓度, 每只鼠腹腔注入0.10.2ml。整个操作应在60min内完成。109 (3) 接种： 腹水用含葡萄糖的无

54、菌Han110 3. 白血病株的接种 腹水型白血病如L1210及P388的接种方法同腹水型肿瘤接种法。110 3. 白血病株的接种 腹水型白血病如111 四、肿瘤细胞的冻存与复苏 为了使肿瘤细胞能得以长期使用，防止退化或变异，保存不同代细胞的特征，对肿瘤细胞或瘤株进行冷冻保存是很必要的。一般在液氮中冻存12年，细胞存活率可达80%90%。 111 四、肿瘤细胞的冻存与复苏112 1.冻存方法 取对数生长期增殖细胞，在冻存前一天最好换一次培养液。经胰蛋白酶消化、离心、洗涤，用含7份培养液、2份小牛血清、1份DMSO配成(15)106个/ml的细胞悬液，转入细胞冻存管，贴上标签，注明细胞来源、名称

55、及冻存日期。 112 1.冻存方法 113 一般将冻存管: 4-30min；20-4h；70-过夜-然后入液氮。 可将冻存管悬挂液氮罐口处过夜，之后浸入液氮中。 可用2cm厚脱脂棉将冻存管严密包裹,2030过夜，然后除去脱脂棉直接放入液氮中。 113 一般将冻存管:114 2.冻存细胞的复苏方法 从液氮罐中取出冻存管，迅速放入38 40水浴中，并不停摇动使其在1min内全部融化，500800r/min离心5min，弃上清，加入培养液，转入培养瓶内培养。次日更换培养液，以后按常规培养。 114 2.冻存细胞的复苏方法 115 细胞冻存及复苏的原则是“慢冻快融”，标准的冷冻速度是每分钟12，到70

56、以下时可迅速放入液氮中。 所冻存的细胞必须是对数生长期的细胞，细胞密度应在106个/ml以上。115 细胞冻存及复苏的原则是“慢冻快融”，标准的冷冻速116第四节人体肿瘤异种移植性肿瘤模型 116第四节117 异种移植性肿瘤是移植性肿瘤的一种，近年很重视人体肿瘤的动物体内移植模型。因为这种模型使用人的肿瘤细胞，在组织形态和遗传特征等方面，均与人类肿瘤相同，故用这种模型可以比较直接研究人类肿瘤的生物学特性及抗肿瘤药物。117 异种移植性肿瘤是移植性肿瘤的一种，近年很重视118 由于异种移植的移植排斥反应常可导致移植失败，故选择适合的受体动物是移植成功的关键。常用的宿主动物主要有裸小鼠和C57BL

57、/6小鼠，也可用免疫抑制剂或放射线等降低动物的免疫功能后，再进行移植。118 由于异种移植的移植排斥反应常可导致移植失败，故选119 一、裸小鼠作为移植宿主 裸小鼠是在SPF屏障系统内繁殖生长的BALB/c裸小鼠，68周龄，体重2122g。 瘤源 人体肿瘤细胞的来源大致可分为两类，一类是人的肿瘤细胞株(系)；另一类是源于人体肿瘤组织块的癌细胞。 常用人癌裸鼠移植的细胞株(系)、接种方式和最佳生长期见教材。 119 一、裸小鼠作为移植宿主 常用人癌裸鼠移植的细120 二、免疫功能抑制的大鼠作为移植宿主 由于裸鼠娇弱，饲养条件要求高，费用昂贵，故用裸鼠复制人体肿瘤异种移植肿瘤模型较难普遍应用。 使

58、用免疫功能受抑制的大鼠接种人癌细胞，可获得人癌动物模型。 先皮下注射阿糖胞苷，2d后用10Gy 60Co全身照射。 120 二、免疫功能抑制的大鼠作为移植宿主121第五节抗肿瘤药物体内研究方法121第五节122 基本步骤是: 低温保存瘤细胞速融加冷培养液洗除冻存液用培养液将肿瘤细胞调至一定浓度给特定动物 (宿主)注射 (ip或sc)。 肿瘤细胞在宿主动物体内增殖后取出给实验动物(受体动物)进行接种(荷瘤动物)。不同肿瘤的宿主动物、取用肿瘤的时间及接种方法见表4-1。122 基本步骤是: 低温保存瘤细胞速融加冷培养液洗123 一、实体瘤() 分组给药 接种次日将动物随机分组：实验对照组(C)：接

59、种肿瘤细胞不给受试药，只给受试药相应的溶剂受试药组(T)：设高、中、低3个剂量（给药1次或数次，给药途径应与推荐临床用药的途径相同，静脉给药者可用腹腔注射代替）。 阳性对照药：对瘤株活性高的已知抗肿瘤药 123 一、实体瘤()124 对S180 , 艾氏腹水癌实体型 可用环磷酰胺20 30 mg /(kg .d) 对L615 可用5-氟尿嘧啶25mg /(kg.d) 对其他腹水型肿瘤一般用丝裂霉素 2mg / (kg.d) 对W256 可用丝裂霉素4mg/ (kg.d)+环磷酰胺20 30mg/(kg.d )124 对S180 , 艾氏腹水癌实体型 可用125 疗效评价 停药24h后处死动物,

60、称体重,剥离瘤块, 称瘤重。受试药物对实体瘤的疗效以瘤重抑制率表示： CT 瘤重抑制率 (%)= 100% C 式中T:受试药物组平均瘤重; C:实验对照组 (模型组,荷瘤未用药动物) 平均瘤重。 (瘤重抑制率%=(1T/C)100%计算）125 疗效评价126 观察瘤重抑制率时，要求实验对照组小鼠瘤重均值不得低于1g（大鼠瘤重均值不得低于2g），否则表示肿瘤生长不良，实验作废。 给药组动物平均体重下降（给药前后自身比较）不得超过15%，动物死亡数不得超过20%，否则表示受试药有毒性反应，应减少剂量重新实验。126 观察瘤重抑制率时，要求实验对照组小鼠瘤重均值不127 若中草药瘤重抑制率大于3