胶陀螺中麦角甾醇的结构修饰及抗结核作用的研究

1、胶陀螺中麦角甾醇的构造修饰及抗结核作用的研究【摘要】目的研究麦角甾醇及类似物7-脱氢胆甾醇氧化后的抗结核作用。方法从胶陀螺中别离得到麦角甾醇，对其氧化得到麦角甾醇过氧化物;并对麦角甾醇类似物7-脱氢胆甾醇进展氧化得7-脱氢胆甾醇过氧化物;用TT法检测其氧化产物的抗结核活性。结果麦角甾醇过氧化物及其类似物的过氧化物当浓度分别超过20，50g/l时有抗结核活性。结论麦角甾醇过氧化物及7-脱氢胆甾醇过氧化物具有一定的抗结核活性。【关键词】麦角甾醇;过氧化物;抗结核Abstrat：bjetiveTstudytheantituberulusativityfxidativeprdutsfErgsterla

2、nd7-dehydrdessterl.ethdsErgsterlasseparatedfrBulgariainquinantsandxygenized;itsanalgue7-dehydrdessterlasalsxygenized.TheantituberulusativityfxygenizedprdutseredetetedusingTTethd.ResultsThexidativeprdutshadantituberulusativityhennentratinfErgsterlperxideexeeded20g/landthe7-dehydrdessterlperxideexeede

3、d50g/l.nlusinThexidativeprdutshasinvariablyantituberulusativity.Keyrds：Ergsterl;Perxidate;Antituberle胶陀螺Bulgariainquinants(PersFr)，又名拱嘴蘑、胶鼓菌等，为子囊菌纲胶陀螺科胶陀螺属真菌，分布于我国东北长白山区，历代本草未见其有关药用记载。此菌有毒1，处理不当食用或食用过多后会出现日光过敏性皮炎型病症2，3。杨晓静等4发现胶陀螺可以明显抑制动物EA艾氏腹水及H22肝癌腹水的细胞生长，且使死细胞数明显增加，说明其具有一定的抗肿瘤作用。结核病(tuberulsis)是由结

4、核杆菌引起的一种慢性传染病，可侵及许多脏器，以肺部受累形成肺结核最为常见。我国的结核病耐药情况非常突出，耐药率高达46%，被世界卫生组织列入特别引起警示的国家和地区之一;局部病人由于对化疗药物过敏、耐药或有毒副作用，不能使用化疗药物或化疗药物对其失去作用5，而天然药物那么可迅速改善结核患者的临床病症，进步疗效，缩短疗程，拮抗化疗毒副作用6。有文献报道7，从植物及海洋生物中提取的二萜类化合物、色胺酮及其类似物、香豆素类等天然活性成分也具有抗结核作用，国外学者AkihisaT从食用蘑菇Hypsizigusarreus中分出麦角甾醇等一系列甾醇化合物，并证明它们几乎都具有良好的抗结核杆菌和抗EB病毒

5、的活性8。本实验从胶陀螺中提获得到麦角甾醇，对其氧化得到麦角甾醇过氧化物，并对麦角甾醇类似物7-脱氢胆甾醇进展氧化得7-脱氢胆甾醇过氧化物;并用TT法检测氧化产物的抗结核活性。1仪器与材料1.1仪器旋转蒸发器(RE-52A，上海亚荣生化仪器厂);循环水式真空泵(SHZ-DA，巩义市英峪华仪器厂);电热恒温鼓风枯燥箱(GZX-GF-9023-BS，上海博泰实验设备);显微熔点测定仪(XT-5，北京科仪电光仪器厂);超导核磁共振谱仪(UNITY-INVA300，美国瓦里安公司);质谱仪(TF-S，英国irass公司)。1.2材料胶陀螺购于延吉市长白山特产品经营部;7-脱氢胆甾醇(纯度97%，Sig

6、a公司);柱层析硅胶和薄层层析硅胶G(80-120目)均为青岛海洋化工产品;显色剂：10%磷钼酸乙醇溶液;化学试剂均为分析纯，由国药集团化学试剂提供。iddlebrk7H9培养基干粉和营养添加剂(AD)均购自美国BD公司;应用液为含10%AD的iddlebrk7H9液体培养基;受试菌株：结核分枝杆菌标准株H37Rv，来自国家菌种保藏中心;DS购自国药公司。2方法与结果2.1提取与别离胶陀螺枯燥子实体4.60kg，70%乙醇溶液回流提取3次，每次3h，合并提取液，浓缩后得到浸膏1.12kg。将浸膏用适量的水分散，依次用石油醚、氯仿、醋酸乙酯、正丁醇萃龋石油醚萃取部位经浓缩后得浸膏16.64g，经

7、硅胶柱层析，用石油醚-醋酸乙酯梯度洗脱，石油醚醋酸乙酯(9010)洗脱物经重结晶得白色针晶。p160162，李伯曼反响阳性，TL的Rf值与麦角甾醇对照品完全一致，混合熔点不下降。故确定白色针状结晶为麦角甾醇。2.2构造修饰2.2.1麦角甾醇过氧化物的制备麦角甾醇3g和亚甲基兰0.5g放于三口瓶中，加二氯甲烷30l使其溶解，通入氧气，并开场搅拌，在烧瓶旁放置碘钨灯，室温条件下过夜反响，TL检测反响完全。反响液和柱层分析硅胶搅拌均匀，干法上样，氯仿-醋酸乙酯梯度洗脱，经减压柱VL纯化得产品2.5g。麦角甾醇过氧化物黄色针晶，p：184185，IR(KBr,-1)见图1:3442.4(H)、2958

8、.3、2872.2、1717.8(=)、1458.3、1383.7偕二甲基、1042.4、972.7(-);HRS:28H463见图2。430.3447,Fund:430.3453;1HNR(400Hz，Dl3)见图3：pp:6.51(1H，d,J=8.4Hz,H-7)，6.25(1H,d,J=8.4Hz,H-6)，5.23(1H,dd,J=15.2、7.6Hz,H-22)、5.14(1H,dd,J=15.2、8.0Hz,H-23)，3.97(1H,H-3);13NR(300Hz,Dl3)见图4。pp:135.6(-6).135.4(-7)、132.4(-23)、130.9(-22)、82.3

9、(-5)、79.6(-8)、66.6(-3)、56.3(-17)、51.8(-9)、51.2(-14)、44.7(-13)、42.9(-24)、39.9(-20)、39.5(-4)、37.1(-10)、34.8(-1)、33.2(-25)、30.2(-2)、28.8(-10)、23.5(-15)、21.0(-27)、20.8(-11)、20.1(-26)、19.8(-21)、18.3(-19)、17.7(-28)、13.0(-18)。2.2.27-脱氢胆甾醇过氧化物的制备同“2.2.1项下方法制得黄色蜡状物。IR(KBr,-1)见图5:3402.4(H)，2927.2，2869.2，1647.

10、7(=)，1466.2，1378.0偕二甲基，1044.1，958.4(-);HRS(27H443)见图6:416.3290，Fund:416.3309;1HNR(400Hz,Dl3)见图7pp:6.52(1H，d,J=8.4Hz,H-7)，6.25(1H,d,J=8.4Hz,H-6),3.97(1H,H-3);13NR(300Hz,Dl3)见图8pp:135.5(-6),130.9(-7)、79.8(-5)、79.6(-8)、66.6(-3)、56.6(-17)、51.7(-9)、51.2(-14)、44.9(-13)、39.6(-20)、37.1(-4)、36.1(-10)、35.4(-1

11、)、34.8(-25)、30.2(-2)、29.9(-12)、28.4(-16)、28.2(-15)、23.9(-11)、23.6(-24)、23.0(-22)、22.7(-23)、20.8(-27)、18.7(-26)、18.3(-21)、14.3(-19)、12.8(-18)。2.3TT法检测抗结核效果2.3.1方法活细胞可以复原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑3-(4,5-diethylthiazl-2yl)-2,5-diphenylterazliubride,即TT，一种四甲基偶氮唑盐，为蓝紫色的不溶于水的甲臜(frazan)，甲臜的生成量在通常情况下与活

12、细胞数成正比。TT法是在液体培养基中参加抗结核菌药物和TT，结核分枝杆菌的生长使培养基中的TT复原成甲臜,甲臜为紫色，不溶于水，以颗粒形式分布于细胞外表，使菌体变成紫色，用肉眼即可观察到，假如药物作用使得结核分枝杆菌生长受到抑制，那么无紫色颗粒生成。本法具有快速简便的特点，一般7d可观察结果。2.3.2受试菌株的制备将受试菌株转入液体培养基于37培养2周，汲取培养菌液少许，置于4l液体培养基中，参加直径23无菌玻璃珠1020粒，振荡2030S，静止沉淀1020in，汲取菌悬液上清，用液体培养基调整比浊至1个麦氏单位，相当于1g/l备用。2.3.3待检物的准备待检物采用两组共11个药物浓度，分别

13、为(6.25，12.5，25，50，100g/l)和(0.625，1.25，2.5，5，10，20g/l)。称取适量待检药，用2%DS溶解成母液，用液体培养基稀释成10倍终浓度的工作液。检测时各取上述工作液20l参加170l液体培养基中，再参加1g/l浓度的待检菌液10l，对照组不加药。377d孵育后，每孔参加TT溶液(5g/l)10l。然后再孵育过夜。假如参加TT后，有紫色沉淀出现，就在有沉淀的孔中参加50l的SDS-DF溶液，再孵育3h。假如颜色从黄色变为紫色即预示着细菌生长。检测结果见表13。表12显示当麦角甾醇过氧化物浓度超过20g/l，结核分枝杆菌不生长，有抗结核活性。表3显示当7-

14、脱氢胆甾醇过氧化物的浓度超过50g/l时，结核分枝杆菌不生长，有抗结核活性。注H37Rv菌株,INHI为0.125g/l,RFPI为0.03g/l,SI为0,25g/l,EBI为0.5g/l。表1TT法对不同浓度下麦角甾醇过氧化物的检测结果表2TT法对不同浓度下麦角甾醇过氧化物的检测结果表3TT法对不同浓度下7-脱氢胆甾醇过氧化物的检测结果3讨论目前，临床上应用的抗结核药物因长期使用和不合理用药已经产生了严重的耐药现象，而且已经有很多报道证实，常用的一线药物对肝脏毒性较大。为此，寻找和开发新的抗结核药物是目前临床研究的重要课题，应用TT快速显色法检测麦角甾醇过氧化物对结核分枝杆菌标准毒力株H3

15、7Rv具有抑制作用，其I为20g/l。7-脱氢胆甾醇过氧化物对结核分枝杆菌标准毒力株H37Rv同样具有抑制作用，其I为50g/l。本实验结果说明，有必要对分子构造中含共轭双键的萜类化合物进展进一步的系统研究，并开发新型的抗结核药物。【参考文献】1胡建友.胶陀螺中毒二例报告J.北京医学,2002,24(3):216.2李茹光.东北大型食用、药用及有毒真菌.长春:东北师范大学出版社,1992:25.3包海鹰,李玉.胶陀螺的光敏活性研究J.食用菌学报,2002,9(4):15.4杨晓静,张泓嵬.胶陀螺的抗肿瘤作用J.特产研究，1993,2:10.5唐神结.耐多药结核病的化学药物研究进展J.中华结核和

16、呼吸杂志,2022,29(8):567.6林明贵,金关甫.耐药结核病及其对策J.传染病信息,2022,18(1):4.7陈国良,谭国良,孙平华.抗结核药物的研究与开发J.药学进展,2022,28(12):534.8魏莉,许重远.食用蘑菇Hypsizigusarreus中甾醇类和聚异戊二烯多羟基化合物的抗结核杆菌和抗EB病毒活性.国外医药植物药分册,2022,21(3):125.转贴于论文联盟.ll.2.2.27-脱氢胆甾醇过氧化物的制备同“2.2.1项下方法制得黄色蜡状物。IR(KBr,-1)见图5:3402.4(H)，2927.2，2869.2，1647.7(=)，1466.2，1378.0

17、偕二甲基，1044.1，958.4(-);HRS(27H443)见图6:416.3290，Fund:416.3309;1HNR(400Hz,Dl3)见图7pp:6.52(1H，d,J=8.4Hz,H-7)，6.25(1H,d,J=8.4Hz,H-6),3.97(1H,H-3);13NR(300Hz,Dl3)见图8pp:135.5(-6),130.9(-7)、79.8(-5)、79.6(-8)、66.6(-3)、56.6(-17)、51.7(-9)、51.2(-14)、44.9(-13)、39.6(-20)、37.1(-4)、36.1(-10)、35.4(-1)、34.8(-25)、30.2(-

18、2)、29.9(-12)、28.4(-16)、28.2(-15)、23.9(-11)、23.6(-24)、23.0(-22)、22.7(-23)、20.8(-27)、18.7(-26)、18.3(-21)、14.3(-19)、12.8(-18)。2.3TT法检测抗结核效果2.3.1方法活细胞可以复原黄色的溴化3-(4,5-二甲基噻唑-2)-2,5-二苯基四氮唑3-(4,5-diethylthiazl-2yl)-2,5-diphenylterazliubride,即TT，一种四甲基偶氮唑盐，为蓝紫色的不溶于水的甲臜(frazan)，甲臜的生成量在通常情况下与活细胞数成正比。TT法是在液体培养基中

19、参加抗结核菌药物和TT，结核分枝杆菌的生长使培养基中的TT复原成甲臜,甲臜为紫色，不溶于水，以颗粒形式分布于细胞外表，使菌体变成紫色，用肉眼即可观察到，假如药物作用使得结核分枝杆菌生长受到抑制，那么无紫色颗粒生成。本法具有快速简便的特点，一般7d可观察结果。2.3.2受试菌株的制备将受试菌株转入液体培养基于37培养2周，汲取培养菌液少许，置于4l液体培养基中，参加直径23无菌玻璃珠1020粒，振荡2030S，静止沉淀1020in，汲取菌悬液上清，用液体培养基调整比浊至1个麦氏单位，相当于1g/l备用。2.3.3待检物的准备待检物采用两组共11个药物浓度，分别为(6.25，12.5，25，50，

20、100g/l)和(0.625，1.25，2.5，5，10，20g/l)。称取适量待检药，用2%DS溶解成母液，用液体培养基稀释成10倍终浓度的工作液。检测时各取上述工作液20l参加170l液体培养基中，再参加1g/l浓度的待检菌液10l，对照组不加药。377d孵育后，每孔参加TT溶液(5g/l)10l。然后再孵育过夜。假如参加TT后，有紫色沉淀出现，就在有沉淀的孔中参加50l的SDS-DF溶液，再孵育3h。假如颜色从黄色变为紫色即预示着细菌生长。检测结果见表13。表12显示当麦角甾醇过氧化物浓度超过20g/l，结核分枝杆菌不生长，有抗结核活性。表3显示当7-脱氢胆甾醇过氧化物的浓度超过50g/l时，结核分枝杆菌不生长，有抗结核活性。注H37Rv菌株,INHI为0.125g/l,RFPI为0.03g/l,SI为0,25g/l,EBI为0.5g/l。表1TT法对不同浓度下麦角甾醇过氧化物的检测结果表2T