重组水蛭素的聚乙二醇修饰

1、重组水蛭素的聚乙二醇修饰李雪芹，候蓓蓓，赵军，田明玉，修志龙*大连理工大学环境与生命学院 大连 116024摘要：目的的 水蛭素素因血浆半半衰期短短而严重限限制了其其临床应应用，聚聚乙二醇醇修饰能能有效地地延长其半衰期期。本文文通过比较较不同修修饰位点点、修饰饰方法所所得单修修饰产物物的比率率、纯度度及其活活性保留留率，从从而得到修饰饰专一性性强且活活性保留留率较高高的修饰饰策略。方法采用用液相和和固相修修饰方法法,用琥珀酰酰亚胺活活化的PPEG 20kkDa分分别在ppH6.0、8.00的条件件下对水水蛭素的的Hiss和Lys进行行定点修修饰；用SDSS-PAAGE分分析产物物的修饰饰度，并

2、并用离子子交换柱柱对修饰饰后的产产物进行行分离，然然后用凝血酶酶滴定法法测定水水蛭素单单修饰产产物的体体外抗凝凝活性。另另外用分子动动力学模模拟方法法预测了pH88.0条条件下PPEG修修饰的位点。结结果 在pH66.0、8.00的条件件下，水水蛭素单单修饰率率都高达达90%以上，但但二者的的单修饰饰活性保保留率相相差较大大。在ppH6.0时，液液、固相相单修饰饰活性保保留率为为34%、34.8%；而在ppH8.0时分分别为555%、96%。结论 在pH88.0 条件下下，采用 “离子交交换柱辅辅助”固相修饰饰的方法法对Lys进行行定点修修饰能得到较高高产率和较高活活性保留留率的单单修饰产产物

3、。关键词：重重组水蛭蛭素；SC-mPEGG；抗凝活活力；分分子动力力学模拟拟 PEEGyllatiion of Reccombbinaant HirrudiinLi Xuueqiin，Houu Beibbei，Zhaao Jun，Tiaan MMinggyu，XXiu Zhiilonng*Deparrtmeent of Bioosciiencce aand Biootecchnoologgy,SSchoool of Envviroonmeentaal aand Bioologgicaal SScieencee annd TTechhnollogyy,Daaliaan Uniiverrsitty

4、 oof TTechhnollogyy,Daaliaan 11160024,ChiinaAbstrractt: OBJEECT Hiiruddin is thee moost pottentt innhibbitoor oof tthroombiin ffounnd iin nnatuure. Allthooughh hiiruddin hass thhe sstroongeest antti-tthroombiin aactiivitty iin vvivoo, iits shoort hallf-llifee inn seerumm siigniificcanttly limmitss i

5、tts cclinnicaal aantiicoaagullantt apppliicattionn. CCurrrenttly, PEEGyllatiion is commmonnly useed aas aan eeffeectiive metthodd too prroloong itss haalf-liffe iin sseruum. Ourr obbjecct oof eexpeerimmentt iss too chhoosse tthe besst PPEGyylattionn meethood aaccoordiing to thee monooPEGGylaatedd re

6、coombiinannt hhiruudinns puriity andd thhe aantiicoaagullantt acctivvityy inn viitroo. METHHODSS Soluutioon mmethhod andd soolidd meethood aassiisteed bby “packed-bed” and anion exchange column were used to favor the formation of mono-PEGylated hirudin. The mild acidic and mild alkaline PEGylation s

7、trategy was used to target His residue and Lys residue of hirudin respectively using SC-mPEG 20kDa. The pegylated products were isolated by anion exchange chromatogram. SDSwas used to analyze the purity of PEGylated hirudin. Thrombin method was used to analyze the anticoagulant activity of PEGylated

8、 hirudin. Molecular dynamics modeling was used to judge the probability of PEGylation site. RESULTS The mono-PEGylated product with a purity of more than 90% was obtained at pH6.0 and pH8.0. But a large difference in anticoagulant activity exists: the anticoagulant activity of solution and solid met

9、hods were 34% and 34.8% respectively at pH6.0；55%、96% at pH8.0. CONCLUSION Solid method assisted by anion exchange column at pH8.0 was a better strategy to get mono-PEGylated r-Hirudin.Key wwordds：recoombiinannt hhiruudinn；SCC-mPEGG；antticooaguulannt aactiivitty；moleecullar dynnamiics moddeliing前言 水

10、蛭素是含含65个氨氨基酸残残基与33个二硫硫键的多多肽，分分子量约约70000，是迄今今为止发发现的特特异性最最好的凝凝血酶抑抑制剂1,而凝血酶酶诱发的的血液凝凝固是诱诱导血管管血栓形形成的重重要原因因，因此此水蛭素素对各种种血栓病病均有疗疗效。然而水蛭素素有一些显显著的药药用缺点点，如血血浆半衰衰期较短短，一般般只有660-1100分分钟，患患者需不不断注射射才能维维持抗凝凝效果，导导致治疗疗成本较较高，且且重复注注射也会会引起一一些不良良反应2-44。上世纪700年代以以来，人人们发现现一些蛋蛋白经过过PEGG修饰后后，很多多方面的的药用特特性大大大改善。之之后，人人们开展展了对于于水蛭素

11、素的PEEG修饰饰研究。George C.Avgerinos5等人采用基因工程方法对水蛭素氨基酸进行改造，用甲基营养酵母 Hansenyla polymorpha特异性表达了只含两个Lys的水蛭素，采用对硝基碳酸酯活化的PEG 5kDa进行修饰，并设计了工业等级纯化步骤。这种对水蛭素修改的方式可以大大提高修饰产物的专一性，但是研究周期性较长且须具备一定的科研条件。国内也有关关于水蛭蛭素PEEG修饰饰的研究究。于爱爱平6等人采采用SPPA-PPEG 5kDDa修饰饰水蛭素素II，采采用Soourcce QQ15离离子交换换柱凝胶胶柱分离离修饰产产物，发发现三修修饰产物物活力大大大降低低，为原原蛋

12、白的的33.5%。秦秦海娜7等人采采用羰基基二咪唑唑法活化化的PEEG 55kDaa修饰水水蛭素，采采用凝胶胶色谱方方法崔修修饰产物物进行分分离，虽虽水蛭素素可与修修饰产物物分离，但但是修饰饰产物之之间未能能分离开开。本实验组旨旨在通过过比较不不同修饰饰位点、修修饰方法法所得单单修饰产产物的比比率、纯纯度及其其活性保保留率来来找到修饰饰专一性性强且活活性保留留率较高高的修饰饰策略。修修饰位点点选择了了Hiss和Lys；修修饰方法法选择了了液相修修饰和 “填料料辅助”、“离子交交换柱辅辅助”两种固固相修饰饰方法。1 材料 基因因工程重重组水蛭蛭素（rr-Hiir）购自大连连高新生生物制药药有限公

13、公司；水蛭素素变异体体2购自重庆庆科润生生物医药药有限公公司；SC-mPEEG 20kDDa购自自北京键键凯科技技有限公公司2 实验方方法2.1 水水蛭素HHis位点的PEGG修饰2.1.11液相修修饰 HVV2与SC-mPEEG 220 kkDa以以摩尔比比 1:1 溶溶于0.2M pH66.0磷磷酸盐缓缓冲溶液液中（PPBS），在25中中反应11.5hh。反应产产物用HiTTrapp Q HP进进行线性性梯度洗洗脱。2.1.22“填料辅助助”的固相修修饰在pH6.0下，将20mmM PPBS与与r-HHir: SCC-mPPEG以以摩尔比比1:33在Q-SSephheroose FF介介质

14、中充充分反应应，反应应完成后后装柱、梯梯度洗脱脱。2.2 水水蛭素LLys位位点的PPEG修修饰2.2.11 液相相修饰 HVV2与SC-mPEEG200 kDDa以摩摩尔比 1:33 溶于0.002 MM pHH8.00 PBBS中，在23下反应应。SC-mPEEG分三三等分三三次加入入，每次次反应330miin。反反应结束束后样品品立即用用HiTTrapp Q HP进进行线性性梯度洗洗脱。2.2.22 “离子交交换柱辅辅助”的固相修修饰 4 ml 1.55mg/ml HV22 溶液液 (溶于于PBSS 200 mMM, ppH 88 A液液）与溶溶于4 mml 220 mmM, pH 8

15、PPBS 中的 SSC-mmPEGG先后以以1 mml/mmin的的流速上上样于柱柱中，使使二者在在柱中充充分反应应后进行行在线梯梯度洗脱脱。3 分析方方法 3.1 SSDSPAGGE参考文献8，15%浓缩胶胶、4%分离胶胶，采用用含5%氯化钡钡的0.1M碘碘液对PPEG进进行染色色。表11为水蛭蛭素PEEG各修修饰产物物的理论论分子量量，可结结合电泳泳图确定定洗脱组组分成分分。表1 水蛭素PEG修饰产物组分理论分子量Table 1 The estimated molecular weights of the PEGylated hirudin 表1 水蛭素PEG修饰产物组分理论分子量Tabl

16、e 1 The estimated molecular weights of the PEGylated hirudin3.2 生生物活性性测定参照文献9的方法法，采用用凝血酶酶滴定法法。3.3 组组氨酸修修饰产物物含量检检测利用SC-mPEEG与r-HHir的的Hiss残基之之间形成成的氨基基甲酸酯酯键对于于中性羟羟胺的敏敏感性测测定组氨氨酸修饰饰位置异异构体的的含量。3.4 LLys修修饰位点点预测采用溶剂可可及表面面积作为为判定赖赖氨酸残残基修饰饰可能性性的判断断标准，运运用分子子动力学学模拟的的方法分分析和预预测液相相和固相相修饰的的位点。结果4.1 水水蛭素HHis位点的的PEGG修

17、饰4.1.11 液相相修饰 44.1.1.11 修饰产物物的分离离纯化液相方法制制备的PPEG化化水蛭素素采用离离子交换换柱进行行分离纯纯化、SSDS-PAGGE法进进行组分分鉴定。图1图1 阴离子交换色谱分离修饰反应混合物（pH6.0）Fig.1 Separation of the PEGylation mixture (prepared at pH6.0) by anion-exchange chromatography 图2图2 修饰产物的电泳结果（15%-5%）Fig. 2 SDSanalysis of PEGylated r-hirudin.结合表1、图2可以推推测出图图1中峰 1，

18、2 ，3分别为为二修饰饰产物、单单修饰产产物、单单修饰产产物。通通过积分分法计算出图1中各峰峰的面积，从从而得出出出各产物物的比例例：峰1：峰2：峰3= 4.774%：94.66%：0.666%，可见单单修饰产产物是主主要的修修饰产物物。4.1.11.2 单修饰饰产物的体体外抗凝凝活性测测定采用凝血酶酶滴定法法对修饰饰水蛭素素进行活活性检测测。图3图3 重组水蛭素以及单修饰重组水蛭素的体外抗凝活性测定Fig. 3 In vitro anticoagulant activity of r-hirudin and monopegylated r-hirudin 图图3显示峰2相对于于未修饰饰的r-

19、hirrudiin其抗抗凝活性性保留率率为344%, 而峰3的抗凝凝活性保保留率为为19.2%。峰2具有较较高的抗抗凝活性性保留率率，并且且是修饰饰反应的的主产物物（峰2占修饰饰反应产产物的994.66%）,因此被选选作本文文的目标标单修饰饰产物做做进一步步的分析析。4.1.11.3 Hiis-修修饰位置置异构体体含量测测定利用SC-mPEEG与r-HHir的的Hiss残基之之间形成成的氨基基甲酸酯酯键对于于中性羟羟胺的敏敏感性测测定组氨氨酸修饰饰位置异异构体的的含量。图4图4 组氨酸修饰位置异构体含量测定Fig. 4 The proportion assay of His-pegylated

20、 positional isomer图4中，峰峰2的79.71%被中性性羟胺断断开为rr-Hiirdiin, 表明Hiis-修修饰位置置异构体体含量为为79.71%，是在在0.22M ppH6.0 PPBS中中修饰反反应的主主要的成成份。4.1.22 “填料辅助助”的固相修修饰 4.1.2.11 修饰饰产物的的分离纯纯化对在pH66.0 20mmM PPBS, r-Hirr：SC-mPEEG=11：3反应所所得固相相修饰产产物，采采用阶段段洗脱的的策略进进行分离离、SDSS-PAAGE法法进行组组分鉴定定。图5图5 固相修饰反应混合物（pH6.0 20mM PBS, r-Hir: SC-mPE

21、G=1:3）的分离纯化Fig. 5 Separation of the solid-phase assisted PEGylation reaction mixture (pH6.0 20mM , r-Hir: SC-mPEG=1:3 )图6 固相修饰反应混合物图6 固相修饰反应混合物(pH6.0 20mM PBS,r-Hir:SC-mPEG=1:3)的纯化产物的电 泳图谱Fig. 6 SDSanalysis of the separation products of the solid-phase assisted PEGylation reaction mixture (pH6.0 20m

22、M PBS, r-Hir: SC-mPEG=1:3 )如图5所示示，峰11为盐浓浓度突然然增大造造成的紫紫外吸收收的波动动，峰22经电泳泳检测,如图6所示，分分子量为为约277KDaa，推断断为单修修饰产物物，峰33经高效效凝胶过过滤检测测，因其其具有和和标准重重组水蛭蛭素相同同的洗脱脱体积，推推断其为为未反应应的水蛭蛭素。4.1.22.2 Hiis-修修饰位置置异构体体含量测测定利用中性羟羟胺法对对修饰位位置异构构体的含含量进行行检测。图7图7 固相辅助单修饰产物高效凝胶过滤图谱Fig. 7 HPSEC analysis of the monoPEGylated product of the

23、 solid-phase assisted PEGylation由图7可知知，中性性羟胺作作用未能能打开mmPEGG与重组组水蛭素素之间的的连接键键，所以以修饰反反应未发发生在HHis551。重重组水蛭蛭素中其其他可能能与mPPEG-SC发发生修饰饰的氨基基酸残基基主要是是Lyss的-氨基基，N-末端氨氨基，文文献报道道N-末端端氨基的的pKa 为7.88，而Lyys的- 氨基的的pKaa 为10.1110，由由于随着着pH的降降低，NN-末端端氨基的的反应活活性将大大于Lyys的- 氨基111,112， 所以在在pH66.0的的条件下下，其反反应活性性较高，故故推测修修饰反应应发生在在N-末

24、端端氨基。 44.1.2.33单修饰饰产物体体外抗凝凝活性测定定采用凝血酶酶滴定法法对修饰饰产物进进行活性性检测。表2 凝血酶滴定法测固相辅助单修饰产物活性表2 凝血酶滴定法测固相辅助单修饰产物活性Table 2 Analysis of the monoPEGylated product of solid-phase assisted PEGylation by thrombin titration method由表2知，单单修饰产产物的抗抗凝活性性为原蛋蛋白（rr-Hiir）的的34.85%。该修修饰产物物的活性性保留率率略高于于液相修修饰反应应所得单单修饰产产物的活活性（334%），由由于

25、pHH6.00,200mMPPBS的的液相修修饰反应应中799.711%的单单修饰产产物的修修饰位点点为组氨氨酸残基基，而相相同反应应条件下下的固相相辅助修修饰的单单修饰产产物的修修饰均未未发生在在组氨酸酸，这是是两种单单修饰产产物活性性差异的的主要原原因。 4.2 水蛭素素Lys位点点的PEEG修饰饰4.2.11 液液相修饰饰产物的的分离纯纯化采用离子交交换柱对对SC-mPEEG 220 kkDa的的修饰产产物进行行分离纯纯化、SSDS-PAGGE法对分离离组分进行行鉴定。图8 SC-mPEG 20kDa液相修饰产物离子交换色谱图图8 SC-mPEG 20kDa液相修饰产物离子交换色谱图Fi

26、g. 8 Ion Exchange Chromatography of the SC-mPEG 20kDa HV 2 prepared in solution phase 图9 SC-mPEG 20kDa液相修饰产物离子交换洗脱物电泳图图9 SC-mPEG 20kDa液相修饰产物离子交换洗脱物电泳图Fig.9 SDSof peaks collected from Fig.8 结合表表1、图9可知，图图8中峰 1, 2分分别为二二修饰和和单修饰饰产物。通过积分法计算出图8中各峰的面积，从而得出各产物的比例：峰1:峰2= 9.7%:90.3%，可见单修饰产物是主要的修饰产物。4.2.22 “离子交

27、交换柱辅辅助”的固相修修饰产物物的分离离纯化对用“离子子交换柱柱辅助”的固相相修饰方方法得到到产物，采采用阶段段洗脱的的策略进进行分离离、SDDS-PPAGEE法进行行组分鉴鉴定。图10 SC-mPEG 20kDa固相辅助修饰产物离子交换色谱图图10 SC-mPEG 20kDa固相辅助修饰产物离子交换色谱图Fig.10 Ion Exchange Chromatography of the SC-mPEG 20kDa HV 2 on column modification图11 SC-mPEG 20kDa固相辅助修饰产物离子交换洗脱物电泳图图11 SC-mPEG 20kDa固相辅助修饰产物离子交

28、换洗脱物电泳图Fig. 11 SDSof peaks collected from Fig.10 洗脱组分鉴鉴定同44.2.1。图10中峰1，2分别为为SC-mPEEG 220kDDa二修饰和单单修饰产产物。通通过积分分法得出图10中各产物物的比例例：峰1：峰2= 3.99%：96.1%。相相比液相相分离在在纯度及及修饰专专一性上上都有了了显著提提高。但但从图8、11比较较中发现现固相修修饰的转转化率比比液相要要低。这这可能是是由于固固相修饰饰中，柱柱内填充充着的离离子交换换介质导导致环境境复杂，蛋蛋白和PPEG在在水溶液液中状态态以及分分子大小小差异使使得它们们在柱中中的分配配不同，致致使反

29、应应物接触触几率降降低。4.2.33 修饰产产物体外外抗凝活活力测定定采用凝血酶酶滴定法法对修饰饰水蛭素素进行活活性检测测。图12 各种单修饰水蛭素体外比活图12 各种单修饰水蛭素体外比活Fig. 12 The specific activity ratios of the mono-PEGylated HV2s in vitro图12所示示，固相相修饰的的蛋白活活力保留留率显著著高于液液相修饰饰。固相相修饰提提高修饰饰反应的的单一性性，且活活力保留留率比较较高。此此种现象象从另一一个角度度说明固固相修饰饰可以提提高修饰饰专一性性。4.2.44水蛭素素修饰位位点的预预测与分分析 采采用溶剂剂可

30、及表表面积法法对水蛭蛭素修饰饰位点预预测发现现：在液液相修饰饰中除LLys447外其它它三个赖赖氨酸的的NH2残基都都比较容容易被修修饰；在在固相修修饰中，Lys 27， Lys 35比Lys 24， Lys 47更易被修饰，又因为Lys27位于N域的核心部位，靠近三个二硫键，因此PEG对K27的修饰会降低水蛭素的活性。而Lys35位于水蛭素的一个柔性很大的伸向溶液的环上，既远离水蛭素/凝血酶作用区，又远离水蛭素的N域核心。因此可以推测，得到的活性较高的PEG修饰产物应该修饰在Lys35上。5 讨论 目目前用于于修饰蛋蛋白质的的活化PPEG种种类较多多,可以以根据蛋蛋白质本本身的特特点和要要求

31、选择择不同种种类的活活化PEEG,例例如,专专一性修修饰肽链链的N端端氨基、半半胱氨酸酸的巯基基、赖氨氨酸的侧侧链氨基基等13。所选选择被修修饰的基基团必须须是蛋白白质功能能的非必必需基团团,否则则将导致致蛋白质质活性下下降甚至至完全丧丧失。本本文选择择了对位于非非活性中中心的Hiss和Lys进进行修饰饰。（1）在ppH6.0的条条件下用用SC-mPEEG 220kDDa对HHis位点进进行定点点修饰。液液相修饰饰中得到到了以组组氨酸位位置异构构体为主主的单修修饰产物物，且目目的单修修饰产物物占修饰饰产物的的94.6%, 是微微酸性条条件下的的主要修修饰产物物，且目的的单修饰饰产物体体外抗凝凝

32、活性保保留率为为34% 。“填料辅辅助”的的固相修修饰中，在pHH6.00 200mM PBSS, rr-Hiir: SC-mPEEG=11:3的的条件下下得到的的单修饰产产物的抗凝活活性保留留率达34.85%。通过过对检测测修饰产产物中SSC-mmPEGG与重组组水蛭素素的偶联联键的检检测，推推断修饰饰位点为为N-末末端氨基基。（2）在ppH8.0条件件下，用用SC-mPEEG 220kDDa对LLys位位点进行行定点修修饰。采采用分子子动力学学模拟法预预测：液液相修饰饰的位点点有Lyys 227、LLys 35和和Lyss 244；Lyys355是固相相修饰的的主要修修饰位点点。在本本实验

33、条条件下，液相修饰和“离子交换柱辅助”的固相修饰中单修饰产物分别占修饰产物的90.3%、96.1%。活性保留率分别为55%,96%。固、液相修饰专一性及纯度与微酸条件下的修饰水平相当，但活性保留率有了显著提高，并且固相修饰明显优于液相修饰。因此在pH8.0 条件下，采用 “离子交换柱辅助”固相修饰的方法对lys进行定点修饰能得到较高比率、纯度且较高活性保留率的单修饰产物。 本实实验实现现了修饰饰反应与与分离的的偶联，减减少了操操作步骤骤，并且且离子交交换辅助助的固相相修饰方方法为水水蛭素的的单修饰饰开辟了了新途径径。但也也存在不不足，如如固相修修饰法的转化化率较低低、活化化PEGG易水解解等问

34、题题，可尝尝试通过过不同离离子交换换填料来来进行分分析研究究。参考文献：1Maarkwwartt,F.“Thhe ddeveeloppmennt oof hhiruudinn ass ann annti-thrrombbotiic druug”,Thrrombb.Rees.,74,1223(119944).2Ryydell,T.J.,Ravvichhanddrann,K.G.,Tullinssky,A.,Bodde,WW.,HHubeer,RR.,RRoittschh,C.,Feentoon,JJ.W,“Thhe sstruuctuure of a ccompplexx off reecomm

35、binnantt hiiruddin andd huumann-tthroombiin”,Sciiencce,2249,27772880(119900).3Ryydell,T.J.,Tullinssky,A.,Bodde,WW.,HHubeer,RR.,“RRefiinedd sttruccturre oof tthe hirrudiin-tthroombiin ccompplexx”,JJ.Mool.BBioll.,2221,58336001(119911).4Maarkwwarddt,FF.,“PPastt,prreseent andd fuuturre oof hhiruudinn”,H

36、Haemmostt. 21(Supppl.1),1126(19991).5Geeorgge CC A, Brriann G T, Kennnetth JJ G et al. Prroduuctiion andd ClliniicallDevellopmmentt off a Hannsennulaa poolymmorppha-Derriveed PPEGyylatted Hirrudiin. Semminaarsin Thhrommbossis andd Heemosstassis, 20001, 3557-3371.6于爱爱平,蒋中华华,钟根深深,董春娜娜,吴祖泽泽。聚乙乙二醇修修饰水蛭蛭

37、素的分分离纯化化与活性性分析。药药物生物物技术，2004 ,11 (5) :302-05.7Haainaa Qiin,ZZhi-Lonng XXiu,Dalliann Zhhangg ett all. Impprovved Anaalytticaal MMethhodss foor PPegyylatted Hirrudiin,CChinnesee J Cheen EEng,20007,115(44):5586-5900.8 SSteppaniiantts SS, IIzraaileev SS, aand Schhultten K. Exttracctioon oof llipiids fro

38、om pphossphoolippid memmbraaness byy stteerred mollecuularr dyynammicss. JJ. MMol. Moodell., 19997, 3:4473 4775.9 VVitaali J, Marrtinn PDD, MMalkkowsski MG et al. J. Biiol. Chhem., 119922, 2267:176670.10MMarkkwarrkt F, Hirrudiin aas iinhiibittor of thrrombbin. Inn S.P.CColoowicck, N.OO.Kaaplaan, edi

39、itioors, Inn: MMethhodss inn Ennzymmoloogy, 1tth eed., Neew YYorkk: AAcaddemiic PPresss, 9244-322，19957.11WWongg, SS. SS. CChemmisttry of prooteiin cconjjugaatioon aand croossllinkkingg. 119911,CRRC PPresss, Bocca RRatoon, FL.12LLee, H., JJangg, II. HH., Ryuu, SS. HH., andd Paark, T. G. N-terrminnal

40、 sitte-sspeccifiic mmonoo-PEEGyllatiion of epiiderrmall grrowtth ffacttor. Phharmm.Rees. 20003,220:8818-8255.13RRobeertssMJ, BeentlleyMMD, Harrriss JMM. CChemmisttry forr peeptiide andd prroteein peggylaatioonJJ.AAdv Druug DDeliiv RRev, 20002, 544(4): 4459-47.附图表 表表1 水水蛭素PPEG修修饰产物物组分理理论分子子量 Taablee

41、1 Thee esstimmateed mmoleecullar weiightts oof tthe PEGGylaatedd hiiruddinPEGyllateed pprodducttsMW/kDDaDi-PEEGyllateed(220 kkDa)HV2247Mono- PEEGyllateed(220 kkDa)HV2227Tri- PEGGylaatedd(5 kDaa)HVV222Di- PPEGyylatted(5 kkDa)HV2217Mono- PEEGyllateed(55 kDDa)HHV212 表2凝凝血酶滴滴定法测测固相辅辅助单修修饰产物物活性Tablee 2 A

42、nnalyysiss off thhe mmonoo-PEGGylaatedd prroduuct of ssoliid-pphasse aassiisteed PPEGyylattionn byy thhrommbinn tiitraatioon mmethhod待滴定样品品所耗标准酶酶活单位位样品浓度（mg/ml）单修饰产物物 1155v 00.0111 rr-Hiir(对照) 300v 00.0001 图1 阴离离子交换换色谱分分离修饰饰反应混混合物（pH6.0）Fig.11 Seeparratiion of thee PEEGyllatiion mixxturre (preeparre

43、d at pH66.0) byy annionn-exxchaangee chhrommatoograaphyy 图2 修饰饰产物的的电泳结结果（115%-5%）Fig.22 SSDS-PAGGE aanallysiis oof PPEGyylatted r-hhiruudinn.注：1:标标准PEEGs；2:图1中的峰1； 3：图图1中的峰2； 4: 图1中的峰3 图3 重组组水蛭素素以及单单修饰重重组水蛭蛭素的体体外抗凝凝活性测测定Fig.33 Inn viitroo annticcoaggulaant acttiviity of r-hhiruudinn annd mmonoopeggylaatedd r-hirrudiin 图4 组氨氨酸修饰饰位置异异构体含含量测定定Fig. 4 Thhe ppropportton asssay of Hiss-peegyllateed pposiitioonall issomeer 注注：1:液相单单修饰产产物（图图1中的的峰2 经中性性羟胺处处理）； 22:液相相辅助单单修饰产产物（图图1中的的峰2）； 3: r-HHiruudinn(对照) 图5 固相相修饰反反应混合合物（ppH6.0 220mMM PBBS, r-HHir: SCC-mPPEG=1:33）的分分离纯化化Fig.