GS和GOGAT酶活性测定

1、实验报告（修改中勿动）9 月8 日 张青谷氨酰胺合成酶（GS）活性测定原理谷氨酰胺合成酶（GS）是植物体内氨同化的关键酶之一，在ATP和Mg2+存在下, 它催化植物体内谷氨酸形成谷氨酰胺。在反应体系中，谷氨酰胺转化为丫一谷氨 酰基异羟肟酸，进而在酸性条件下与铁形成红色的络合物，该络合物在 540nm 处有最大吸收峰，可用分光光度计测定。谷氨酰胺合成酶活性可用产生的Y谷 氨酰基异羟肟酸与铁络合物的生成量来表示，单位ymolmg-iproteimh-i。也可 间接用540nm处吸光值的大小来表示，单位Amg-i proteimh-i。【仪器与用具】冷冻离心机；分光光度计；天平；研钵；恒温水浴；剪刀

2、；移液管2ml、1ml）。 【试剂】提取缓冲液：0.05mol/LTris-HCl，pH8.0，内含 2mmol/LMg2+，2mmol/L DTT，0.4mol/L 蔗糖。 称取 Tris （三羟甲基氨基甲烷）1.5295g, 0.1245g MgSO47H2O, 0.1543g DTT （二 硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HCl （0.1mol/L = 1ml 的36%38%浓盐酸加入到100ml去离子水里）调至pH8.0,最后定容至250ml； 反应混合液A （0.1mol/L Tris-HCl缓冲，pH7.4）以加入i.6mi反应混合液a的为对照

3、。 内含 80mmol/L Mg2+， 20mmol/L 谷氨酸钠盐，20mmol/L 半胱氨酸和 2mmol/L EGTA，称取 3.0590g Tris，4.9795 gMgSO47H2O, 0.8628g 谷氨酸钠盐，0.6057g 半胱氨酸，0.1920gEGTA，去离子水溶解后，用0.1mol/L HCl调至pH7.4，定容 至 250ml；反应混合液B （含盐酸羟胺，pH7.4）：反应混合液A的成分再加入80mmol/L盐酸羟胺，pH7.4； 显色剂（0.2mol/L TCA, 0.37mol/L FeCl3 和 0.6mol/L HCl 混合液）： 3.3176g TCA （三氯

4、乙酸），10.1021g FeCl36H2O,去离子水溶解后，加5ml浓盐 酸，定容至 100ml；40mmol/L ATP溶液：0.1210g ATP溶于5ml去离子水中（临用前配制）。【方法】粗酶液提取 称取植物材料3 穗（ 大约 12粒左右，记录重量）于研钵中， 加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4C下15,000g离心 20min,上清液即为粗酶液。 反应1.6ml反应混合液B,加入0.7ml粗酶液和0.7ml ATP溶液，混匀，于37C下保温半小时，加入显色剂1ml,摇匀并放置片刻后，于5,000g下离心10min,取上清液测定540nm处的吸光值，以加入1.6m

5、l反应混合液A的为对照。粗酶液中可溶性蛋白质测定 取粗酶液0.5ml,用水定容至100ml,取1ml用 考马斯亮蓝G-250测定可溶性蛋白质（见实验28）-需要补完。4原始数据记载5.结果计算：GS 活力（A mg -1 proteimh -1）= 式中 A540nm 处的吸光值； P粗酶液中可溶性蛋白含量（mg/ml）； V反应体系中加入的粗酶液体积（ml）； T反应时间（h）。GOGAT活性测定材料与方法（红色字样为实验药品，口标注为药品配置方法）一修改用 粗酶液提取同GS。【试剂】1提取缓冲液：【 0.05mol/L Tris-HCl ， pH8.0 ，内含 2mmol/L Mg2+ ，

6、 2mmol/L DTT， 0.4mol/L 蔗糖。称取Tris（三羟甲基氨基甲烷）1.5295g, 0.1245g MgSO47H2O, 0.1543g DTT （二硫苏糖醇）和34.25g蔗糖，去离子水溶解后，用0.05 mol/L HC1 （0.1mol/L = 1ml 的 36%38%浓盐酸加入到 100ml 去离子水里）调至 pH8.0，最后定容至250ml； 20 mmol/ L 的 a-酮戊二酸， 10 mmol/ L 的 KCl20mmol/ L的L-谷氨酰胺以不含l-谷氨酰胺 （glutamine ）的反应液为对照3 mmol/ L NADH （便用之前配置）5 （需要核查）

7、25 mmol/L的Tris - HCl缓冲液（pH 7.6）【称量三羟甲基氨基甲烷（Tris） 0.757125g,并用PH指示剂以及0.1mol/L盐酸溶液调整PH值至7.6,再定容 至 250ml】方法】实验前准备35 度水浴锅和 100度水浴锅各一个。粗酶液提取 称取植物材料3 穗（ 大约 12 粒左右，记录重量）于研钵中，加3ml提取缓冲液，置冰浴上研磨匀浆，转移于离心管中，4C下15,000g 离心20min，上清液即为粗酶液。测试样品和对照都加入0.3 mL酶液与0.5 mL 20 mmol/ L的a-酮戊二 酸和0.1 mL 10 mmol/ L 的 KCl 和0.2 mL 3

8、 mmol/ L NADH,然后测试 样品加入0.4 mL 20mmol/ L 的 L-谷氨酰胺 （以不含l-谷氨酰胺（guamine）的反 应液为对照） 注：配完后，总体积3.0 mL,不足部分用25 mmol/L的Tris -HCl缓冲液（pH 7.6）补足（测试样品补1.5mL,对照补1.9mL）。于30C的 水浴中保温30 min后，于沸水中杀死酶活性30 s,于340 nm处读取吸光 度，以不含L-谷氨酰胺（glutamine）的反应液为对照。酶活性用氧化的NADH量（以OD34o值减少量表示）来计算GOGAT的活 力，以30C每1 h减少zOD34o等于0. 01为1个酶活性单位，最后依 据样品籽 粒数 和稀释倍数计算酶的活性，单位为 unit/(grain *h)附注：Tris-hcl 配置方法：Tris-HCI 缓冲液(0.05 mol/L)50毫升0.1mol/L三羟甲基氨基甲烷(Tris)溶液与X毫升0.1mol/L盐酸混匀并稀释至100 毫升。pH (25C) X (mL) TOC o 1-5 h z 45.744.743.44