重组结核分枝杆菌Mr 38 000蛋白的表达、纯化和鉴定

1、重组结核分枝杆菌Mr 38 000卵白的表达、纯化和断定摘要从h37rv基因组中扩增r38000卵白基因并高效表达和纯化。用pr技能从结核分枝杆菌h37rv基因组中扩增r38000卵白序列，将其与pge-t-easy载体毗连转化e.lidh5，构建重组克隆载体pge-t-easy/r38000，测序准确后将目的基因片断克隆入pqe-80l原核表达载体并转化e.lidh5，iptg诱导目的卵白表达。经estern-blt断定目的基因与(his)6交融表达，将已表达的卵白质通过ni-nta亲和色谱柱举行纯化。pr得到结核分枝杆菌r38000卵白基因，测序效果与gebank中报道的完全同等。sds表

2、现，在r为38.5103处有相应的卵白质表达条带，esernblt断定为(his)6交融表达卵白。经ni-nta亲和色谱柱举行纯化后可得到纯化的卵白。乐成克隆了铁调治卵白基因r38000卵白序列，并在e.lidh5高效表达，亲和层析后得到了纯化目的卵白。关键词r38000卵白;表达;纯化;结核分枝杆菌；lning,expressinandpurifiatinfr38000prteinfrybateriutuberulsiszhanging，lijin-heng，linhangkeyrdsr38000prtein;expressin;purifiatin;ybateriutuberulsis(t

3、b)结核分枝杆菌ybateriutuberulsis,tb是结核病(tuberulsis,tb)的病原体。其在患者体内重要为细胞内生长。诊断要领的短缺是结核病盛行的紧张缘故原由。如今常用的ppd试验，常使bg疫苗接种者被误检为阳性1，且对后期结核患者敏感性较低，存在显着不敷。比年来，有研究创造r38000卵白具有强的免疫原性，而成为结核分枝杆菌抗原的研究热门2,3，大概成为结核病血清学诊断试剂和疫苗研究的候选抗原之一。为此，我们在原核表达载体中表达结核分枝杆菌r38000卵白并对其举行了纯化，为进一步研究其抗原性和重要成效提供便利。质料和要领1.1质料tb毒株h37rv、dh5由本室保存;pg

4、e-t-easy及izardpluspurifiatinsyste购自prega公司；x-gal，限定性内切酶bah,er及t4-dna毗连酶，taqdna聚合酶均为takara公司产物；iptg,dtt,dte,小量质粒提取试剂盒均为siga公司产物，胶接纳试剂盒为vitagene公司产物。1.2要领2效果2.1r38000卵白片断的扩增及序列测定经30个循环pr扩增，可得与估计长度相称的片断图1。将dna接纳后插入pge-t-easy载体，经测序证明所扩增的r38000序列与gebank数据库所收录的r38000序列完全同等。:dnaarkerdl2000;1:r38000基因pr产物;图

5、1pr扩增r38000卵白基因产物琼脂糖凝胶电泳10g/l效果2.2表达载体的构建pqe-80l经bahi和er双酶切后与r38000基因目的片断举行毗连反响后，转化感觉态e.lidh5。挑取的克隆子举行酶切断定，切出约1151bp巨细片断的为阳性克隆子(图2)，定名为pqe-80l-r38000。:dnaarkerdl2000;1,2:pqe-80lr38000;图2pqe-80l-r38000重组质粒bahi和er双酶切断定效果2.3r38000卵白在pqe-80l表达载体中的诱导表达将pqe-80l-r38000经37活化留宿，经iptg诱导表达后做sds阐发，从电泳图中可以看出在r为3

6、8.5103同等处出现了一条表达带，表达量约占菌体总卵白的20%(图3)。：卵白分子量arker;1:未诱导的pqe-80l-r38000质量重组菌e.lidh5;2-4:诱导的pqe-80l-r38000质量重组菌e.lidh5;图3(his)6-r38000交融卵白的sds阐发2.4目的卵白的断定所构建的重组质粒表达的r38000卵白以带有6个组氨酸的交融卵白的情势出现，利用鼠抗(his)6ab验证r38000卵白的表达。效果表如今r为38.5103处有一显色带，而比较无相应条带(图4)。：卵白分子量arker;1:(his)6-r38000prteinexpressin2.dh5图4(h

7、is)6-r38000交融卵白的esternblt阐发效果2.5目的卵白的可溶性阐发将上清和沉淀别离所制样品，举行sds阐发表白表达产物重要在细菌裂解后的沉淀中，而上清中那么很少(图5)。：卵白分子量arker;1:未诱导的pqe-80l-r38000质量重组菌e.lidh5；2：诱导菌超声裂解后沉淀;3:诱导菌超声裂解后上清;图5(his)6-r38000交融卵白的可溶性阐发2.6目的卵白的纯化纯化的产物经sds阐发可在r为38.5103处得到一条清楚的条带(图6)。：卵白分子量arker;1:未诱导的pqe-80l-r38000质量重组菌e.lidh5;2:诱导的pqe-80l-r3800

8、0质量重组菌e.lidh5;3,4:(his)6-r38000纯化卵白图6(his)6-r38000交融卵白的表达及纯化3讨论r38000卵白是一种磷酸盐转运卵白，含有对结核分枝杆菌特异单克隆抗体定位的7个表位，具有较强的抗原性，已经得到告终核病研究学者们的同等成认。1992年，bthaley4等以为r38000卵白是研究菌阴性肺结核最有效的抗原之一。2022年ark5等通过卵白质基因芯片和病人血清挑选，创造r38000卵白是空洞性肺结核所特有的卵白抗原。本实行中应用的pqe-80l表达载体为4751bp，起始码卑劣接有6个组氨酸，双链环状，ap抗性，多克隆位点有17个单一限定性酶切位点。pr

9、产物共有约1150bp，与r38000卵白基因巨细相切合。r38000克隆入pqe-80l载体中与6个组氨酸交融，可产生共约390个氨基酸的交融卵白，r为38.5103摆布，实行效果与理论值相切合。交融卵白有(his)6的表达，因此通过检测组氨酸的表达，可间接证明r38000卵白表达，同时(his)6的表达为进一步纯化卵白提供了亲和位点，它可与ni+特异性结合，通过ni-nta亲和色谱柱可得到纯化的目的卵白。我们在原核表达体系中乐成表达结核分枝杆菌的r38000卵白，并举行了开端断定和纯化，为下一步深化研究r38000卵白的成效奠基了基矗参考文献1brittnj,palengira.iprvi

10、ngvainesagainsttuberulsisj.iunalellbil,2022:81(1):3445.2rldhealthrganizatinglbaltuberulsisntrl-surveillane,planning,finaning,hrept2022,rldhealthriganizatin,gengeva.3laals,skeikyya.iune-basedethds,intuberulsisandthetuberlebaillusj.aeriansietyfrirbilgypress,ashingtn,d.2022,7183.4bthaleygh,rrudd,ffestenstein.linialvalueftheeasureentfybateriutuberusisspeifiantibdyinpulnarytuberulsisj.zthrax,1992,47:270275.5arkj,sa