葡萄糖氧化酶活力测定分光度法

1、文档编码 : CB6L1M3D9T5 HO8E7S3R3B8 ZG4Y9L4B4J10葡萄糖氧化酶活力测定（分光度法）1.原理（1）葡萄糖氧化酶的催化特性：葡萄糖氧化酶的每个酶分子中含有两单位 FAD （黄素腺嘌呤二核苷酸）,作为受氢体催化葡萄糖氧化生成葡萄糖酸,并产生过氧化氢；氧化酶 C6H12O 6+O2= C6H12 O7+H 2O2 在确定时间内葡萄糖经氧化酶催化发生反应后,可算出葡萄糖氧化酶的活力；测定其反应液的过氧化氢浓度即（2）葡萄糖氧化酶催化葡萄糖氧化产生的过氧化氢在确定 pH 值的缓冲溶液中和加热条件下能使靛蓝胭脂红发生褪色反应,并且其反应速度在确定范畴内和过氧化氢浓度成正比

2、,据此测定出产生的过氧化氢的量,进而运算出葡萄糖氧化酶活力；（3）第一利用一系列浓度的过氧化氢标准溶液与靛蓝胭脂红反应,在 615nm 波特长测定吸光度,建立标准曲线；然后,作葡萄糖氧化酶催化葡萄糖反应,再取其反应液与确定浓度的靛蓝胭脂红溶液反应随后测定其在 615nm 波特长测定吸光度,将吸光度值代入标准曲线方程后可推算出氧化酶活力；2 药品（1）葡萄糖溶液:称取一水葡萄糖定容于时备用,2 天 100.00mL 冷藏3 小内有效；（2）1010-3mol/L 靛蓝胭脂红溶液：称取靛蓝胭脂红定容于 1000mL；（2）0.2M 醋酸-醋酸钠缓冲溶液pH=5.2 ：称取三水醋酸钠及 冰醋酸定容至

3、 1000mL （4）12mg/L 过氧化氢标准溶液：精确称取0.040g 30%的过氧化氢溶液（过氧化氢需事先标定取实际值）定容于 1000mL；3 试验方法（1）标准曲线的绘制精确吸取0,1,2,3,4,5,6mL 过氧化氢标准溶液12mg/L,分别置于第 1 页,共 3 页-3 25mL 比色管中,加人1.3mL 靛蓝胭脂红溶液10 10 mol/L 和30mL 乙酸一乙酸钠缓冲液,再加人蒸馏水稀释至25mL 配成含有过氧化氢,mg/L, mg/L , mg/L, mg/L, mg/L , mg/L 的溶液,于沸 水浴中加热13min 后,用流水冷却比色管5min；用1cm 比色皿,以蒸

4、馏水作参比,在波长615nm 处测定其吸光度,以吸光度对过氧化氢浓度作图（分光度作横坐标,过氧化氢浓度为丛坐标）得标准曲线方程；（2）按酶活大小称取适量葡萄糖氧化酶以醋酸- 醋酸钠缓冲液稀释至约6U/mL 的浓度,某些酶产品水溶性很差,加稀释液混均定容好后需过滤取滤清夜测定；（3）将稀释好的酶液置于37水浴中计时保温5 分钟；（4）吸取葡萄糖溶液置于比色管中,将其放入37水浴中计时保温5分钟；（5）保温时间到后吸取10 酶稀释液加入上述预放有葡萄糖溶液分钟；的比色管中混匀,保温反应（6）取出比色管转置于冰浴中,同时取一25mL 具塞比色管中,分别加入乙酸一乙酸钠缓冲溶液30 mL 和的靛红溶液

5、,再加入 1mL 的上述反应液,稀释至刻度,于沸水浴中加热13min 后,取出用流水冷却5min,终止反应；（7）用1cm 比色皿,在波长615nm 处,以蒸馏水作参比,测定其吸光度A0；（8）空白样测定时,先加三氯醋酸后加酶稀释液,其余各步凑相同；4 运算葡萄糖氧化酶活力定义为：37条件下,1min 内催化葡萄糖反应产 1g 过氧生化氢（H2 O2）所需的酶量为1U；X0 =（A-A 0 *K+C 0 ）*25*10 -3 *10 * （4/1）* （1/2）/10 3（A-A 0*K+C 0 ）*5 X= X 0*N/m X0 ：酶稀释液的酶浓度,U/mL A：样液的吸光度值A0 ：样液的吸光度值 K：标准曲线的斜率C0：标准曲线的截距第 2 页,共 3 页25：反应液稀释25 倍 10 -3 ：单位换算,毫升转为升 3 10 ：单位换算,毫克转为微克 4/1：从4 毫升反应液中吸取1 毫升用于