葛根抗氧化有效部位的提取分离

1、葛根抗氧化有效部位的提取分离Extraction and Isolation of Antioxidative Principle from Radix Puerariae lobataeZHONG Wei-yan1, JIANG Hai-qiang1, WANG Jian-ping1*, ZHANG Tao2, YU Peng-fei1(1. Shandong University of Traditional Chinese Medicine, Jinan 250355, China;2. Academy of Military Medical Sciences, Beijing 1008

2、50, China)：Objective To investigate the extraction and isolation of antioxidative principle from Radix Puerariae lobatae and probe into the best extraction plan. Methods By Fenton ultraviolet spectrophotometry, the antioxidative activity were compared amongthe rinsed part by distilled water, the rin

3、sed part by 70 % ethanol and total extraction part. The L9(34) orthogonal experimental design was used to optimize the extraction condition. Results The factors in the preliminary test had obvious influences on the extraction and separation. The best extraction and separation method was as follows:

4、hot reflux after crushing, purifying by macroporous adsorption resin and eluting with 70 %ethanol. The activity of antioxidation was the rinsed part by 70 %ethanol total extraction part the rinsed part by distilled water. The optimal technological condition was as follows:extractionwith 8 times of 7

5、0 %ethanol at 100 Cfor 3 times （1.5 hours each time）. Conclusion This study confirms the flavones have evident antioxidative activity and the optimal technological condition is stable, simple and feasible.葛根为豆科植物野葛 Pueraria lobata （Wiled.） Ohwi的根， 主要成分为葛根素、大豆苷元、大豆苷等异黄酮类化合物。现代 药理研究表明，葛根总黄酮具有降血压、减慢心率、

6、扩张冠状动 脉、降低心肌耗氧量、改善心、脑血液供应等作用，治疗高血压 引起的头痛、头晕、耳鸣等症状有明显疗效。我们研究了葛根总 黄酮的提取工艺，用大孔树脂法分离总黄酮，并用紫外分光光度 计测定了总黄酮含量 1 。1仪器与试药仪器721型分光光度计（上海精密实验仪器厂）； ZK-28 真空干 燥器（上海实验仪器厂） ； UV-3010 型紫外可见分光光度计（日 立）。试药葛根（购自山东淄博鼎立中药材公司， 经山东中医药大学药学院周凤琴老师鉴定）；葛根素标准品（中国药品生物制品鉴定 所)；D101型大孔吸附树脂；所用试剂均为分析纯。实验方法2.1 提取工艺流程 2葛根称重溶剂提取抽滤浓缩定容上柱洗

7、脱液 浓缩真空干燥粗提物抗氧化活性的测量221原理 根据Fen ton方法产生？OH自由基的模型， H2O2与Fe2+反应生成？OH自由基,该反应式为：Fe2+ +H2O2 Fe3+ ?Oh+ 0H-水杨酸能有效地捕捉？OH自由基且生成有色产物，在 510 nm 处被较强吸收， 从而可在反应一定时间后， 测定吸光度值 (A0)。 若在该体系中再加入黄酮类化合物，由于它能清除？OH自由基，从而使有色物质的浓度降低。在此条件下测定体系的吸光度值(Ax)则可用于计算黄酮类化合物对 ？OH自由基的清除效率，清 除效率(% = (A0- Ax) /AO X 100 %。抗氧化活性体外测定方法 3在25

8、mL刻度试管中依次移取 2 mmol/L FeSO4溶液2 mL 6 mmol/L H2O2溶液2 mL,混合均匀后加入 6 mmol/L水杨 酸溶液6 mL,在3637 C恒温水浴中保温 15 min，用分光光 度计测其A值，即得A0值。在A0测定体系中，分别加入一定浓度的供试品溶液，在3637 C恒温水浴中保温15 min,用分光光度计测 A值，即得 Ax 值2.3 紫外分光光度法测总黄酮含量 4以葛根素标样， 用外标一点法， 测定葛根粗提物中总黄酮的 含量。2.3.1标准曲线的绘制精密称取标准品葛根素2 mg置于10mL量瓶中，加95 %乙醇溶解定容，摇匀后分别取0.1 , 0.2 ,0

9、.3，0.4，0.5，0.6 mL 置于 10 mL 量瓶中，各加乙醇 1.0 mL， 再用蒸馏水定容，摇匀。以乙醇作为空白对照，在250 nm波长处测吸光度（A），以吸光度值为纵坐标，标准品浓度为横坐标， 绘制标准曲线 5 ，见图 1。运用最小二乘法得线性回归方程为： y =70.114 x + 0.104 9， R2= 0.994 6 ，呈良好的线性关系。2.3.2样品溶液的配制精密称取粗提物10 mg置 于10 mL量瓶中，加95 %乙醇溶解定容，摇匀后精密取1 mL置于25 mL量瓶中定容，同时吸取1 mL乙醇同法处理作为空白对照，于250nm处测吸光度，由回归方程计算总黄酮含量6。2

10、.4 预实验影响葛根中总黄酮化合物提取的因素有上柱纯化方法 （聚酰 胺与大孔树脂）、溶媒（水与 70 %乙醇），分别对这几项因素 做预实验，以初步确定各因素的影响程度及适用范围 6 。取 10 g同粒度药材分别用水和 70 %乙醇提取，上大孔树脂柱收集洗脱 部位，用2.3的方法测250 nm处的吸光度，结果是 70 %乙醇提取效果好。然后再取 10 g 同样药材用 70 %乙醇提取，同样条件 下分别上聚酰胺和大孔树脂柱收集洗脱部位，测250 nm处的吸光度，结果是大孔树脂柱分离纯化效果好。再取10 g 相同药材，70 %乙醇提取，大孔树脂柱分离，分别测定水洗脱部位、70 %乙醇洗脱部位、 总提

11、取部位的自由基清除率， 结果对自由基的清 除效果为醇洗脱部位 总提取部位 水洗脱部位。因此用 70 %乙 醇提取，大孔吸附树脂分离纯化 7 ，醇洗脱部位的抗氧化活性 较高。正交试验 以上讨论了各因素对葛根总黄酮得率的影响，但实际操作 中，其他因素也影响黄酮的得率，且各因素之间相互交叉影响。 为全面考察各影响因素， 我们设计了 4 因素 3 水平正交试验 8 ， 见表13。通过对各因素的综合评价，由极差大小可见，A、B、C、D4因素影响黄酮得率的主次顺序为：A D C Bo由表4可见最佳提取工艺为： A2B2C1D，3 即用 8倍于原材料的 70 %乙醇热回流 提取 3 次，每次 1.5 h 。结论 本实验以葛根素为对照品用紫外分光光度法比较各分离部 位的抗氧化活性： 醇洗脱部位 总提取部位 水洗脱部位。 紫外分 光光度法测定葛根总黄酮含量的方法可行且操作简单。 提取分离 的最佳工艺为：用 8倍于原材料的 70 %乙醇回流提取 3次，每次 1.5 h预实验结果表明， 不同溶剂提取、 上柱方法均可影响总黄酮 得率。70 %乙醇提取要好于水煮液， 可能是因水煮液中