双水相萃取技术在分离纯化中应用

1、双水相萃取技术在分别_纯化中的应用(精)双水相萃取技术在分别_纯化中的应用(精)28/28双水相萃取技术在分别_纯化中的应用(精)第39卷第8期化工技术与开发Vol.39No.82010年8月Technology&DevelopmentofChemicalIndustryAug.2010综述与进展双水相萃取技术在分别、纯化中的应用谭志坚,李芳香,邢健敏(中南大学化学化工学院,湖南长沙410083纲要:双水相技术是一种新式的液-液萃取技术,因为其条件平和、易操作等特点,目前已广泛应用于物质的分别、纯化。本文综述了双水相形成原理、工艺流程和特色、系统种类、影响双水相分派的要素及其在分别纯化中的应用

2、,并针对其将来发展趋向进行了展望。重点词:双水相萃取;分别纯化;应用中图分类号:TQ028.32文件表记码:A文章编号:1671-9905(201008-0029-07基金项目:国家自然科学基金(项目编号:20956001通信联系人:李芳香(1964,女,湖南邵阳人,教授,博士生导师,研究方向:植物活性成分提取及分别纯代,E-mail:收稿日期:2010-03-30与传统的分别技术比较,双水相技术作为一种新式的分别技术,因其体积小,办理能力强,成相时间短,合适大规模化操作等特色1,已经愈来愈遇到人们的重视。Beijeronck在1896年将琼脂水溶液与可溶性淀粉或明胶水溶液混淆,发现了双水相现

3、象。双水相萃取(Aqueoustwo-phaseextraction,ATPE技术真实应用是在20世纪60年月,1956年瑞典伦德大学的Albertsson将双水相系统成功用于分别叶绿素,这解决了蛋白质变性和积淀的问题2。1979年德国Kula等人将双水相萃取分别技术应用于生物酶的分别,为此后双水相在应用生物蛋白质、酶分别纯化确立了基础。迄今为止,被成功应用于生物医药工程,天然产物分别纯化,金属离子分别等方面46。因其广泛的应用性,已经发展成为一种相对成熟的技术,但仍有很大暗藏的价值等候我们去开发。双水相的形成1.1双水相的形成机理将2种不相同的水溶性聚合物水溶液(或聚合物与必定浓度的盐溶液混

4、淆时,当聚合物浓度(或盐的浓度达到必定值,系统会自然分红互不相溶的两相,这就是双水相系统。双水相系统的形成主假如因为高聚物之间的不相溶性,一般以为只需两聚合物水溶液的憎水程度有所差异混淆时即可发生相分别,且憎水程度相差越大,相分别偏向也就越大。1.2双水相系统的特色双水相萃取与传统的水-有机溶剂萃取时相同的,都是利用物质在两相间的分派系数不相同来实现分其余。可是与传统萃取比较,双水相有其独到之处79:(1两相的溶剂都是水,上相和下相的含水量高达70%90%(w/w,不存在有机溶剂残留问题。条件很平和,常温常压操作,不会惹起生物活性物质失活或变性;(2两相界面张力小,仅为10-610-4N/m(

5、一般体系为10-310-2N/m,双水相的两相差异(如密度、折射率相差很小,萃取时两相可以高度分别,传质速度快,但也惹起乳化现象;(3溶剂对目标组分选择性强,大批杂质能与全部固体物质一起除掉,使分别过程简化,易于工业放大和连续操作;(4分相时间短,常温常压下自然分相时间一般为510min;(5目标产物的分派系数一般大于3,大部分状况下目标产物的收率较高;(6聚合物的浓度、无机盐的种类和浓度,以及系统的pH值等多种要素都可以对被萃取物质在两相的分派产生影响,因此可以利用多种手段来使反响达到最正确条件;(7该系统可以办理以固体微粒形式出现化工技术与开发30第39卷的样本。因其大多是由必定量的聚乙二

6、醇和盐构成,因此也比较经济。1.3双水相的种类最常有的双水相系统是聚乙二醇(PEG/葡聚糖(Dextran和PEG/无机盐(硫酸盐、磷酸盐等系统。双水相按构成一般分为:聚合物-聚合物,聚合物-低分子量组分,聚合物-无机盐,高分子电解质-高分子电解质以及新出现的研究比较热点的温度引诱,表面活性剂等双水相系统1011,详见表1。表1常有双水相萃取溶液系统的种类Table1commonaqueoustwo-phaseextraction种类上相构成下相构成聚合物-聚合物聚乙二醇聚丙二醇聚蔗糖甲基纤维素聚乙烯醇,葡聚糖,甲基聚丙二醇,聚乙烯醇,葡聚糖,葡聚糖,羟丙基葡聚糖,葡聚糖聚合物-低分子量组分,

7、葡聚糖,丙醇,聚丙烯乙二醇,磷酸钾等聚合物-无机盐聚乙二醇铵磷酸钾,硫酸钾,硫酸镁,硫酸高分子电解质-高分子葡聚糖硫酸钠羧甲基葡聚糖钠盐羧甲基纤维素钠盐电解质羧甲基纤维素钠盐离子液体双水相水性离子液体BMImCl、HMImCl、OMImCl、BPyCl、TBACl等K3PO3、K2HPO4、Na2HPO4、(NH42SO4、K2CO3等温度引诱双水相EOPO等K2HPO4、Na2HPO4等表面活性剂双水相阳离子TTAC、CPC、C12NE等阴离子SDBS、SDS等2双水相的萃取原理,工艺流程及其影响要素2.1双水相的萃取原理双水相系统萃取分别原理与基本的液液萃取是相同的,是鉴于物质在双水相体系

8、中的选择性分派。当物质进入双水相系统后,在上相和下相间进行选择性分派,这种分派关系与常例的萃取分派关系比较,表现出更大或更小的分派系数。当物质进入双水相系统后,因为表面性质、电荷作用和各样力(如憎水键、氢键和离子键等的存在和环境的影响,使其在上、下相中的浓度不相同。其分派规律遵照Nernst分派定律,即K=Ct/Cb,此中分别为上相和下相的浓度,K为分派系数。各样物质的分派系数K是不相同的,因此双水相系统对生物物质的分派拥有很大的选择性。2.2工艺流程12考虑到双水相技术用于分别纯化以及回收再利用方面,我们大体将其工艺流程分为3个方面:目的产物的萃取;PEG的循环;无机盐的循环。以分别细胞中蛋

9、白质为例,其工艺流程图见图1。图1双水相萃取工艺流程图Fig.1Thetechnicalprocessofaqueoustwo-phaseextraction(1目标产物的萃取。把细胞的匀浆液倒入由PEG和(NH42SO4构成的双水相系统中,此后让其静置分层,等系统坚固后,蛋白质将分派到上相,即PEG相。而细胞碎片、核酸、纤维素均分派到了下相,即(NH42SO4相,此后把上下相分别。接着是把目标蛋白质转移到盐相,方法是在上相中加入盐,形成新的双水相系统,从而将蛋白质与PEG分别,以利于使用超滤或透析将PEG回收利用和目标产物的进一步加工办理。(2PEG的循环。在进行工业上大规模分别纯化操作时,

10、要特别注意原料的回收利用,这样既有益于环保又节俭了成本。PEG的回收有两种方法:一种是加入盐使目标蛋白质转入富盐相往返收,另一种是将PEG相经过离子互换树脂,用洗脱剂先洗谭志坚等:双水相萃取技术在分别、纯化中的应用31第8期去PEG,再洗出蛋白质。常用的方法是将第一步萃取的PEG相或除掉部分蛋白质的PEG相循环利用。(3无机盐的循环。将盐相冷却,结晶,此后用离心计离心进行分别回收。其余方法有电渗析法、膜分别法回收盐类或除掉PEG相的盐。2.3影响双水相均衡的主要要素1314影响双水相萃取均衡的主要要素有:构成双水相系统的高聚物种类、高聚物的均匀分子量和分子量散布、高聚物的浓度、成相盐和非成相盐

11、的种类、盐的离子浓度、pH值、温度等。不相同聚合物的水相系统显示出不相同的疏水性,聚合物的疏水性按以下序次递加:葡萄糖硫酸盐糖葡萄糖羟丙基葡聚糖甲基纤维素聚乙二醇聚丙三醇,这类疏水性的差异对目的产物互作用是重要的。PEG分子量:同一聚合物的疏水性随分子量的增添而增添,这是因为分子链的长度增添,其所包含的羟基减少。两相亲水差距越大,其大小的选择性依靠于萃取过程的目的和方向。关于PEG聚合物,若想在上相收率较高,应降低均匀分子量,若想在下相收率较高,则增添均匀分子量。pH值:(1pH值会影响蛋白质分子中可解离公司的解离程度,因此改变蛋白质所带的电荷的性质和大小,这是与蛋白质的等电点有关的;(2pH

12、值能改变盐的解离程度(如磷酸盐,从而改变相间电位差。萃取温度:温度第一影响相图,在临界点周边特别显然。但当远离临界点时,温度影响较小。大规模生产常在常温操作,但较高升温仍是有益于降低系统黏度,利于分相。无机盐浓度:盐的正、负离子在两相间分派系数不相同,两相间形成电位差,从而影响带电生物大分子的分派。无机盐浓度的不相同能改变两相间的电位差。双水相技术在分别纯化中的应用双水相技术作为一种生化分别技术,因为其条件平和易操作等特色,因此可调理要素好多,并且可交融传统溶剂萃取的成功经验,使其成为一种生物工程下游初步分其余方法。因为传统的的有机溶剂萃取简单使生物大分子(如蛋白质和酶失活,在双水相发展初期,

13、人们致力于把双水相技术应用于蛋白质等的分别纯化,从而大大降低其变性的可能性。目前,双水相萃取技术已成功应用到蛋白质、酶、核酸、氨基酸、抗生素以及生物小分子等的分别纯化。近些年来,双水相萃取技术获得很大的发展,产生了好多新式的系统,并且在天然产物,金属离子分别纯化等方面也拥有广泛的应用。3.1在提取酶和蛋白质中的应用这是双水相系统研究和应用最多的方面,对发酵液、细胞培育液、植物、动物组织中细胞内、外的酶和蛋白质均可提取。工业上已有几种双水相系统用于从发酵液中分别提取蛋白质和酶,绝大部分是用PEG作上相成相聚合物,葡聚糖、盐溶液和羟甲基淀粉的此中一种作下相成相物质。GiselaTubio,Guil

14、lermoA等15利用PEG/柠檬酸钠双水相系统从牛胰腺中萃取胰蛋白酶。实验商讨从-胰凝乳蛋白酶中分别胰蛋白酶的最正确条件,此后将其应用到从牛胰腺中分别胰蛋白酶。实验最正确条件为:PEG(w/w-3350与柠檬酸钠构成双水相系统,在pH值为5.2时拥有最正确分派性能。增添NaCl的浓度到0.7%以及减少比较到0.1时能在上相获得60%的胰蛋白酶,是纯化前的3倍。胰蛋白酶质量浓度增大到整个系统的25%(w/w时对产率和纯化因子都没有特别大的影响。因此能证明该双水相的灵巧性以及将其应用到规模生产的远景。SaroteNitsawang,RajniHatti-Kaul等16利用8%(w/w的PEG及1

15、5%(w/w的(NH42SO4构成的双水相系统从番木瓜乳浆中萃取木瓜蛋白酶,这类方法能在较短的时间内获得高纯度的木瓜蛋白酶并且不会损坏酶的成分,同时在分别时可以直接使用木瓜胶乳而不需要除掉其余可溶性的物质,这类更快更简单以及坚固性好的方法能大规模地应用到木瓜蛋白酶的萃取中间去。NatliaLuizaPennaDallora17用PEG和氨基甲酸铵形成的双水相萃取目标蛋白。实验研究了牛乳蛋白酶(BSA,胰蛋白酶,溶解酶3种蛋白质在不相同质量分数PEG(1500,4000,6000和氨基甲酸铵形成的双水相系统中的分派行为。实验得出了3种蛋白酶在不相同系统中的分派系数,牛乳蛋白酶的分派系数在0.10

16、.8,胰蛋白酶在1.02.4,溶解酶在2.39.0之间变化。其结果与聚合物分子量及节线长度有很大的关系。从实验结果得出的各样蛋白酶的分别因子能达到较高的水平,因此此方法可以作为分别蛋白质的一种很好的下游办理方法。化工技术与开发32第39卷Mirjana、G.Antov等人18用10%(w/wPEG1500和20%(w/w(NH42SO4作为双水相系统,萃取木聚糖酶。当酶的初级制品浓度为70%(w/w,调理pH值在5.1的条件下,分派系数和上相产率分别达到了85.6%和97.37%,纯化因子为4.8。实验结果表示了把双水相系统作为下游过程分别纯化木聚糖酶的可行性。Lorena、Capezio等1

17、9用聚乙二醇/磷酸盐双水相系统分别转基因牛奶中的乳清蛋白。研究了牛奶乳清蛋白中4种成分牛血清白蛋白(BSA、-乳清蛋白(ALA、-乳球蛋白(BLG、-抗胰蛋白酶(AAT在双水相系统中的分派行为。BSA和ALA富集在PEG相,分别系数分别达到了10.0和27.0,BLG和AAT对磷酸盐相更拥有亲和性,分别系数分别为0.07和0.01。pH值增大会使这些蛋白质的分别系数增添,可是PEG分子量的增添使分别系数减少。使用PEG1500以及在pH值为6.3,比较R为41时,关于AAT能达到最正确萃取条件,产率达到80%,纯化因子为1.51.8之间。3.2在抗生素的提取和纯化中的应用抗生素药物平常是经过生

18、物合成获得的,其目的产物在转变液中产率很低,且对酸、碱、有机溶剂和温度变化都比较敏感,简单变性和失活,若以常例的吸附、萃取、离子互换和积淀等方法办理,一般萃取法一次转移其实不可以将杂质充分除掉,须多次萃取,溶剂损失大,并且抗生素在提取过程中易变性失活而双水相技术能保证其在平和的条件下获得分别纯化。Bora等20商讨了用PEG/盐双水相系统萃取头孢类抗生素,在最正确条件:PEG-600和Na2SO4构成双水相系统,pH为8.0,PEG和Na2SO4浓度各为20%时,头孢类抗生素在双水相系统中优秀的分派系数(达到了3.5以及疏水性都证了然该实验的可行性。BabakMokhtarani,RaminK

19、arimzadeh等21用PEG、Na2SO4和H2O构成双水相系统,萃取分别环丙沙星。实验研究了温度、盐浓度、聚合物的浓度以及分子量的大小等对实验结果的影响。实验采纳矩形的星点设计-平行面法去商讨影响环丙沙星的分派行为的要素。结果表示环丙沙星分派与盐浓度有很大关系,它能显然减小环丙沙星的分派系数。聚乙二醇在低浓度时能减小环丙沙星的分派系数,可是在高浓度时能增添其分派系数,但聚合物的分子量没有显然的影响,温度对环丙沙星分配系数的影响与PEG的浓度是相同的。结果显示环丙沙星的质量浓度抗衡体的分配拥有相对较小的影响,相同,PEG的分子量对环丙沙星的分派行为的影响几乎可以忽视不计。实验最正确条件为:

20、温度为10,PEG分子量为1500,Na2SO4和PEG的质量分数分别为9.8wt.%和19.6wt.%。YangyangJiang22等用PEG与C4mimPF6(溴化1-丁基-3-乙基咪唑形成的离子液体双水相萃取青霉素。当达到相均衡时,青霉素的萃取率达到了95.8%。实验按萃取过程分为3个步骤:(1在咪唑-PEG系统中加入Na2HPO4形成双水相,青霉素被萃取到富含聚合物的相,即PEG相;(2疏水性的离子液体C4mimPF6加入到上述双水相中,把咪唑-PEG从青霉素去萃拿出来;(3在离子液体中的咪唑-PEG被从C4mimPF6获得回收。经过这3个步骤,不只能很好地萃拿出青霉素,并且咪唑-P

21、EG,离子液体都能获得回收,因此是一种绿色的萃取方法。3.3在天然产物活性成分提取的应用目前,从天然产物中提取有效的药用成分已经遇到了愈来愈大的关注。中草药是我国医药宝库中的珍宝,已有数千年的历史。但因为天然植物中所含的化合物众多,特别是中草药有效成分比较难以确立及提取技术还不可以熟,使得我国传统中药难以获得国际市场的认同。因此,采纳拥有较高选择性和专一性的双水相萃取技术对中草药有效成分的提取是一项很存心义的工作。石慧,陈媛梅23利用25%PEG-400与12%的(NH42SO4双水相系统从加杨叶粗提液中萃取分别总黄酮,用紫外分光光度法直接测定总黄酮含量。试验在pH=9,NaCl的增添量为3%

22、,粗提液3mL,温度25的最正确实验条件下,加杨叶总黄酮萃取率达到了95%以上。该试验方法拥有优秀的精巧度和选择性,为黄酮类化合物萃取分别供给了一种有效的方法。I.-HorngPan,Hsi-HoChiu等24把双水相萃取技术与简单乙醇办理联合起来,除去过分的无机盐,发展成从栀子花提取栀子苷。该双水相系统由PE62(一种共聚物由20%的环氧乙烷和80%的环氧丙烷构成、磷酸氢二钾和乙醇构成。为研究最正确反谭志坚等:双水相萃取技术在分别、纯化中的应用33第8期应条件,各样可变要素包含盐浓度、聚合物浓度、样品加入量和乙醇的加入量都获得了观察。实验结果表示增添盐浓度和减少PE62浓度可以增添栀子苷在富

23、盐相的浓度。增添乙醇以及样品加入量也能提升栀子苷在富盐相的分派效率,实验大规模萃取时最正确反响条件为:5%PE62、7.5%K2HPO4,10%乙醇。实验中由500g栀子花能获得39g纯度为77%的栀子苷,因此这个过程拥有优秀的工业应用远景。Chethana,ChetanA.Nayak等25初次把双水相萃取作为一种下游分别过程应用到从甜菜中萃取甜菜红碱。实验观察了却线长度(TLL、比较、相浓度、PH值、盐浓度等变量对实验结果的影响,甜菜红碱和糖分别分派到上相(PEG相和下相(硫酸铵相。实验的最正确条件为:PEG-6000-(NH42SO4-H2O构成双水相系统,当结线长度(TLL为34%,比较

24、为1.3,上相能获得70%75%的甜菜红碱,下相能获得80%90%的糖。增添NaCl浓度会使甜菜红碱的产率降低,pH为3.0时甜菜红碱的产率最高,但pH值变化对糖的产率影响不大。随后采纳有机-液体萃取法把上相的PEG与甜菜红碱进行分别,能使甜菜红碱的浓度增添3.4倍。3.4在金属离子分别中的应用传统的金属离子溶剂萃取方法存在着溶剂污染环境、对人体有害、运转成本高、工艺复杂等弊端。近来几年来,利用双水相技术萃取分别金属离子达到了较高的水平。与传统的分别工艺比较,双水相系统对贵金属以及罕有金属的分别与检测拥有环境友善、荒弃物少、对人体无害、运转成本低以及工艺简单等长处。张磊,陈亮等26利用聚乙二醇

25、-硫酸铵双水相系统萃取分别荒弃印刷线路板处理液中的金。实验在温度为25,pH为1.0,PEG2000的质量分数为15%,(NH42SO4的质量分数为20%的最正确萃取条件下,经过三级萃取,金萃取率达到97.56%。富集金的PEG相无需反萃取可直接用Zn置换出单质金,复原率达到95.16%。张焱,亓新华等27利用Cd(与乙基紫(EV、KI缔合后,把盐析剂加入到丙醇-水双水相系统萃取分别镉。在(NH42SO4存在条件下,无表面活性剂EV的加入,以及加入必定酸性条件下存在的碘离子,Cd(萃取率只有68%,而相同条件下,加入mg级用量的EV后,达到了完满分别。实验还观察其余如Fe(,Co(等离子搅乱要

26、素,结果表示了这些离子都获得完满分别。用双水相系统对g含量的含镉废水经过滤净化办理后可直接排放,对治理重金属镉对水的污染拥有参照价值。VaniaGoncalvesLacerda等28用(EO11(PO16(EO11三嵌式共聚物与硫酸锂组成双水相系统萃取分别Ni-Cd电池中的镍和镉。对这些金属在上下相产生疏派影响的要素有提取剂碘化钾的加入量、结线长度(TLL的大小、上下相的质量比、电池样品的滤出和稀释因子。当电池样品由盐酸滤出,最正确条件:62.53%(w/wTLL,KI的浓度为50.00mmolkg-1,两相质量比为0.5,样品稀释系数为35时,共聚物相Cd的产率达到了99.2%,Ni分派到盐

27、相,产率达到90.4%。TianxiZhang,WenjunLi等29研究了鉴于聚乙二醇和盐的双水相系统萃取一价的金属氰化物Au(CN2-。在不加萃取剂的状况下,绝大部分Au(CN2-被萃取到PEG相,该双水相系统拥有很好的萃取性能,并且pH值变化对萃取没有显然的影响。在PEG相中加入Zn,可以显然减少Au(CN2-的含量,PEG相不会发生改变从而可以被重复利用。因为该系统的无毒和不燃性使得该方法成为了一种在碱性条件下分别金属氰化物的既洁净又安全的方法。双水相萃取技术展望双水相萃取技术作为一种新式的萃取分别技术,有着好多的长处,但也存在着一定的限制性。一是成相聚合物的价钱,如被广泛研究的是PE

28、G-dextran系统,葡聚糖比较昂贵,并且系统黏度大;其余从成相聚合物中分别目标产物也比较困难,一些如超滤,电泳,色谱分别等技术成本也较高30。因为常有双水相系统存在不足,及其应用愈来愈广泛,近些年来出现了好多新的双水相系统。(1低价的双水相系统,用变性淀粉、乙基羟乙基纤维素等取代昂贵的葡聚糖,用羟基纤维素、聚乙烯醇等取代PEG,可制成低价的双水相系统31。科学家也研究了用粗葡聚糖或水解的葡聚糖,但都没有获得很好的见效,SanjoyGhosh等研究了用低价的dextranT40取代昂贵的dextranT50。(2温度引诱双水相系统,环氧乙烷-环氧丙烷共聚物(EO-PO拥有34化工技术与6开发

29、第39卷较低的浊点，在水溶液中，当温度超出其浊点时会形成新的两相，目标产物分派在水相，而富含EO-PO的一相得以回收。Rados?awDembczyski33研究用EO50PO50与磷酸钾构成的温度引诱双水相系统从鸡蛋白中萃拿出了溶解酵素。(3去污剂形成的双水相系统，去污剂形成的胶束与高分子聚合物形成的空间构造不可以互相浸透，从而致使分相，产生聚合物/去污剂两相系统。A.Rodenbrock34使用了农乳尔1205洁净剂双水相萃取角质酶肽。(4表面活性剂双水相系统，表面活性剂双水相是指正、负离子表面活性剂混淆水溶液在必定浓度及混淆比范围内，自觉分别形成的两个互不相溶的水相。因为表面活性剂拥有亲

30、水基和亲油基的构造特色，使得这类双水相在萃取分别时拥有选择性好。PunjapornWeschayanwiwat等35使用阴阳离子(十烷基二苯和十二烷基三甲基溴化铵表面活性剂双水相应用到分别废水中的苯。双水相与有关技术的集成也成为其发展的一种趋向，如与磁场、超声波、高效层析、电泳等技术的集成，既提升了分别效率，又简化了分别流程以及提升回收等优点。参照文件:1Jose?nePersson,Hans-OlofJohansson,etal.Aqueouspolymertwo-phasesystemsformedbynewthermoseparatingpolymersJ.Bioseparation,2

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