实验一-细菌转化课件

1、基因工程实验课办公电话：3029114基因工程实验课办公电话：3029114主讲人：王兴平Email：细 菌 转 化主讲人：王兴平细 菌 转 化一、实验目的感受态细胞的制备方法。掌握质粒DNA转化感受态受体菌技术。一、实验目的感受态细胞的制备方法。主讲人：王兴平Email：细 菌 转 化主讲人：王兴平细 菌 转 化二、实验原理转化指用氯化钙处理宿主细胞（大肠杆菌JM109）,以利其将DNA重组子转入细胞内，在宿主细胞内进行增殖。感受态细胞：即通过0.1M CaCl2处理细胞，增加膜对DNA的通透性，以增加细胞吸收外源DNA的效率，即细胞处于能摄入核酸分子时的生理状态。二、实验原理转化指用氯化钙

2、处理宿主细胞（大肠杆菌JM109）三、实验器材、试剂1.器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液器吸头，1.5ml 微量离心管，双面微量离心管架，干式恒温气浴（或恒温水浴锅），制冰机，恒温摇床，培养皿（已铺好固体LB-Amp），超净工作台，酒精灯，玻璃涂棒，恒温培养箱。2.试剂：30%甘油、0.1M CaCl2、氨卞青霉素（Amp）水溶液、X-gal、IPTG水溶液、LB培养液、含Amp的LB固体平板 。三、实验器材、试剂1.器材：旋涡混合器，微量移液取样器，移液四、感受态细胞的制备复苏Ecoli JM110菌株，于LB平板上划线接种，37培养9-10h。挑单菌落接种于300mL LB液体培养基

3、（三角瓶）中，37振荡培养5-6h，（或者取原菌1:100加入到LB中，37振荡培养3-4h）使细胞处于对数生长期（用紫外分光光度计测定菌至OD600值达到0.4-0.5）。分装6大管，每管50mL，冰上预冷30min，4000转，4离心5min。四、感受态细胞的制备复苏Ecoli JM110菌株，于LB平弃上清，每管加10mL预冷至0的0.1M CaCl2（液体中有冰粒时效果最好），合为2管后，每管再补10mL 0.1M CaCl2至40mL，冰浴30min，4000转，4离心5min。弃上清，每管加10mL预冷至0的0.1M CaCl2后，重悬菌体沉淀，合为1管，冰浴10-15min，即得

4、感受态细胞。四、感受态细胞的制备弃上清，每管加10mL预冷至0的0.1M CaCl2（液体现制现用，或加入20mL等体积的30%的灭菌甘油。分装200管（每管200 l），投入液氮快速冷冻后，-70保存。用标准质粒进行转化，若长出许多蓝斑菌落，证明感受态细胞的效价高。四、感受态细胞的制备现制现用，或加入20mL等体积的30%的灭菌甘油。四、感受态取一支感受态细胞在冰上解冻后，将100l感受态加入到10l的连接产物中，混匀。冰浴30min。42水浴90sec（其间勿摇晃离心管）。立即冰浴2min。加入800l LB液体培养基（不加Amp），于37，小于200rpm振荡培养1h以复苏细胞。五、转化

5、的操作步骤取一支感受态细胞在冰上解冻后，将100l感受态加入到10给4l IPTG和40l X-gal充分混匀后用三角玻棒均匀地涂布于含100g/mL Amp的LB选择性平板上，待液体被吸干即可用于涂布转化的细菌。将复苏好的细胞3000转离心2min，丢上清800l，轻柔地将细菌悬浮，涂板。待液体完全渗入琼脂后，倒扣平板，于37温箱中培养10h以上。取出置于4放置数h，重组子筛选。五、转化的操作步骤给4l IPTG和40l X-gal充分混匀后用三角玻棒六、转化率及其影响因素 载体DNA及重组DNA 受体细胞 转化操作 试剂纯度与器皿的洁净度 六、转化率及其影响因素 载体DNA及重组DNA 参考资料参考资料影响转化效率的因素有哪些？白色菌落出现的原理是什么？思考题影响转化效率的因素有哪些？思考题经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量Study Constantly, And You Will Know Everything. The More You Know, The More Powerful You Will Be写在最后经常不断地学习,你就什么都知道。你知道得越多,你就越有力量写感谢聆听不足之