分子靶向治疗在恶性肿瘤中的应用和进展课件

1、分子技术在肿瘤靶向药物治疗的应用 肿瘤靶向治疗（Target therapy of cancer）依据已知肿瘤发生的异常分子和基因，设计和研发针对这些特定的分子和靶点药物，选择性杀伤肿瘤细胞的治疗方法；靶向治疗的前提就是明确肿瘤的特异靶基因变异类存在与否和变异类型；个体化治疗的雏形。荧光原位杂交（ Fluorescence in situ hybridization，FISH ）技术简介FISH = Fluorescence In Situ Hybridization利用荧光标记的DNA探针检测组织或细胞内与其互补的DNA片段应用：遗传病诊断 血液肿瘤 实体瘤样本：羊水、绒毛、流产组织、外周血

2、、骨髓、体液及各种肿瘤组织等用已知的标记单链核酸为探针，按照碱基互补的原则，与待检材料中未知的单链核酸进行异性结合，形成可被检测的杂交双链核酸。由于DNA分子在染色体上是沿着染色体纵轴呈线性排列，因而可以探针直接与染色体进行杂交从而将特定的基因在染色体上定位荧光标记探针探针变性样本DNA变性杂交工作原理检测技术特点不同类型的淋巴瘤染色体易位类型不同优点适用于形态学上难以诊断且IHC结果不理想的标本；适用于细胞数量少，形态不典型的活检及穿刺组织。必须结合组织形态学和免疫组化结果作最后诊断！FISH基因检测在淋巴瘤的应用淋巴瘤FISH检测基因临床应用套细胞淋巴瘤IGH/CCND1融合基因辅助诊断滤

3、泡性淋巴瘤BCL2/IGH融合基因辅助诊断、判断预后弥漫性大B细胞淋巴瘤BCL6基因断裂重组辅助诊断、判断预后伯基特淋巴瘤C-MYC基因断裂重组辅助诊断粘膜相关淋巴组织淋巴瘤MALTI基因断裂辅助诊断胃粘膜相关淋巴组织淋巴瘤API2-MALTI融合基因指导治疗 BCL6基因断裂-辅助诊断弥漫性大B细胞淋巴瘤 BCL6基因断裂重排-判断预后目前研究确定至少40%的DLBCL涉及BCL6基因重排。 一项针对102名DLBCL患者的BCL6重排情况及其与预后关系的研究显示，BCL6阳性患者诊断治疗36个月后，疾病停止发展的比率为82%，携带有BCL6重排的病例预后较好。 BCL6 基因断裂与弥漫性大

4、B细胞淋巴瘤Offit, K. N Engl J Med, 1994. 331(2): p. 74-80.结果判读l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个融合信号。API2/MALT1基因检测试剂盒 探针：GLP API2/GLP MALT1凋亡抑制因子2基因（apoptosis inhibitor-2,API2）,位于11号染色体;粘膜相关淋巴组织基因（Mucosa-associated lymphoid tissue 1 ,MALT1 ），位于18号染色体。 API2基因与MALT1基因的融合导致凋亡抑制的增加，引起细胞不依赖于抗原刺激的生存

5、优势。 l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个融合信号。BCL2/IGH重排发生在约80%-85%的FL患者中，检测BCL2/IGH基因重排可以辅助诊断FL。 BCL2/IGH阴性的FL患者3年生存率为100%，而阳性者只有54%； 阴性者3年疾病无进展为87.5%，而阳性者只有13%。 BCL2/IGH融合基因与滤泡性淋巴瘤 BCL2/IGH融合基因-辅助诊断滤泡性淋巴瘤 BCL2/IGH融合基因-判断预后l 正常细胞：两个红色信号，两个绿色信号。l 异常细胞：一个红色信号，一个绿色信号，两个融合信号。结果判读-阳性结果结果判读-阳性结果 约

6、80%的伯基特淋巴瘤病例发生t(8；14) （q24;q32）； 约15%的伯基特淋巴瘤病例发生t(2；8)(p11;q24)； 约5%发生t(8；22)（q24;q11）。 染色体易位导致C-MYC基因断裂重组可能是伯基特淋巴瘤的一个标志，可以应用于临床上伯基特淋巴瘤的辅助诊断。C-MYC基因断裂与伯基特淋巴瘤 辅助诊断伯基特淋巴瘤 结果判读-阳性结果FISH技术在乳腺癌靶向治疗应用乳腺癌Her-2基因及蛋白检测Cerb-B-2 :3+ 完全强膜阳性细胞30% 2+,1 +,- FISH检测是否有基因扩增Her2基因检测流程石蜡组织标本IHC检测再用FISH方法检测1+3+2+Hercept

7、in治疗+再用FISH方法检测Herceptin治疗FISH检测+再用FISH方法检测+A. 无须计数的大簇团信号（高度扩增）B. 颗粒状信号（R10，高度扩增）C. 须计数的颗粒状信号（R=3.5，低度扩增）ACBHer-2基因扩增状况30%的肿瘤细胞全部的细胞膜高强度着色免疫组化（3+）与FISH对比 40100浸润性导管癌级IHC：+FISH：呈簇团状高度扩增100免疫组化（）与FISH扩增阳性浸润性导管癌级IHC：FISH：呈簇状扩增肿瘤细胞不着色40100基因突变检测方法1.RNA酶A切割(RnaseAcleavage) 2.变性梯度凝胶电泳(DGGE)3. 杂合双链分析法(HA)4

8、. 化学切割错配(CCM) 5.碳化二亚胺检测(Carbodiimide,CDI) 6.酶促切割错配(Enzyme Mismatch Cleavage, EMC) 7.单链构象多态性 (Single-Strand Conformation)8.切割片段长度多态性 9.DNA测序(Sequencing) 10.双脱氧指纹图谱法(Dideoxy Finger-printing, ddF)11.错配接合蛋白检测 12.蛋白截短测试（protein truncation test）方法13.变性的高效液相色谱检测(Denaturing High Performance Liguld Chromatog

9、raphy DHPLC) 14.DNA芯片技术(DNAchip) 15.等位基因特异性扩增16.等位基因特异性寡核苷酸片段分析(Allele-Specific Oligonucleotide,ASO)17.引物延伸检测(Primer Extension,PEX)18.寡核苷酸连接检测(Oligonucleotide Ligation Assay,OLA)19.限制性片段分析(Restriction Fragment Analysis）20.突变体富集PCR法（mutant-enriched PCR）21.蝎形探针扩增阻滞突变系统（Scorpions amplification refracto

10、ry mutation system）肺癌组织EGFR基因扩增和突变检测及其临床意义研究背景研究显示吉非替尼对部分晚期NSCLC患者的治疗效果非常显著。存在EGFR基因突变的患者更有可能对吉非替尼的治疗敏感。 存在EGFR基因扩增的肺癌、肠癌病人对分子靶点药物更为敏感。检测大肠癌有无EGFR过度表达，只要1%的癌细胞的胞膜强阳性染色即判断为3+，可作为应用西妥昔单抗的指征。 FISH检测EGFR基因扩增标本类型：石蜡包埋组织（手术、活检、穿刺） 冰冻组织 胸、腹水沉渣细胞 探针类型：GLP EGFR / CSP7 定量PCR检测EGFR基因突变分型 突变类型： 19 exon （2235-22

11、49位点）15bp缺失突变 19 exon （2240-2257位点）18bp缺失突变 19 exon （2240-2251位点）12bp缺失突变 21 exon 2573位点TG碱基置换突变 21 exon 2582位点TG碱基置换突变 EGFR基因变异检测双体性三体性多体性扩 增EGFR基 因 FISH 检 测 状 况肺癌石蜡 FQ-PCR分型技术检测EGFR突变存在EGFR突变肺癌样本的琼脂糖凝胶电泳图71例肺癌组织中检测出6例突变样本FQ-PCR 检测15bp缺失阳性病例结果 红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线，按荧光信号值的高低依次为 9号、12号、13号、55号、38号

12、和33号标本 15bp缺失突变型DNA的测序图 senseantisense红色阈值线以上的扩增曲线即为阳性标本的扩增曲线，按荧光信号值的高低依次为2号、36号、和40号标本 FQ-PCR 检测18bp缺失阳性病例结果 目前K-RAS突变检测常用技术方法直接测序焦磷酸测序高分辨率熔解曲线PCR-RFLP芯片杂交Real-Time PCR肿瘤组织的确认和筛选显微切割肿瘤提取DNA相应的PCR反应或杂交相关的分析和检测K-ras突变检测基本流程图直接测序(Direct Sequencing)PCR扩增后产物直接测序双脱氧核苷酸链终止法(Sanger法) DNA 片段是荧光标记的，这些片段经过平板胶

13、电泳或毛细管电泳得到分离，荧光分子被激发而发光，发出的光信号被检测系统检测 K-ras突变检测结果疗效预测标志物与预后判断标志物疗效预测标志物：能够预测某种特定治疗方式疗效的标记物KRAS基因突变导致肿瘤对EGFR抑制剂抵抗预后判断标志物：在不考虑治疗因素的情况下能够判断患者结局的标记物18号染色体长臂（18q）缺失 某些分子标志物兼具两种作用胸腺嘧啶合成酶（Thymidylate synthase）EGFR 作为预后因子的价值EGFR expression correlates with poor prognosisDFS = Disease-free survival; OS = over

14、all survivalTumor typePrognosisSurvivalRisk of metastasisReferencesColorectalPoorPoor-Decreased OSIncreased-Hemming (1992)Mayer, De Jong (1992)Head & Neck (SCCHN)PoorPoorDecreased DFSDecreased OS-Grandis (1998)Maurizi (1996)Lung (NSCLC)PoorPoorDecreased OS -IncreasedOhsaki (2000)Pavelic (1993)Cetuxa

15、mab(西妥昔单抗)人源化嵌合单抗（ IgG1 ）靶向作用于表皮生长因子受体（EGFR）阻断EGF 和TGF与EGFR 的结合，抑制酪氨酸激酶活性和其后的肿瘤生长200年获得FDA审批资格治疗结直肠癌Panitumumab（帕尼单抗）完全人源化单克隆抗体(IgG2)靶向作用于表皮生长因子受体（EGFR）2005年7月获得FDA快速通道审批资格治疗结直肠癌结直肠癌分子靶向治疗药物 KRAS 突变KRAS 突变可不依赖EGFR受体途径，自行激活RAS/MAPK 通路导致ERBITUX 耐药KRAS 突变与Erbitux疗效及患者生存相关KRAS 突变并非孤立事件KRAS 突变常伴随BRAF突变，并

16、与 CpG 岛甲基化表型(CIMP)1,2相关KRAS 突变常伴随 PI3K 突变3 Livre A, et al. J Clin Oncol 2008;26:374379MAPK = mitogen-activated protein kinaseK-ras基因野生型患者能从这类药物治疗中获益。 K-ras基因突变型患者并不能从抗EGFR治疗中获益,反而徒增不良反应危险和治疗费用；抗EGFR治疗和K-ras突变相互排斥K-ras基因抗EGFR治疗关系密切2009年7月FDA批准了对西妥昔单抗和帕尼单抗说明书标签的修改： 结直肠癌分子靶向治疗药物 注明KRAS基因突变的结直肠癌患者不推荐这使用

17、这两种用药物。 K-ras基因突变: 20-60%结直肠癌 K-ras基因突变发生在肿瘤恶变的早期，原发灶和转移灶的K-ras基因高度保持一致K-ras基因突变 NCCN临床实践指南指南明确指出所有转移性结直肠癌患者 都应检测K-ras基因状态。 美国美国临床肿瘤学会(ASCO)推荐把K-ras基因突变检测作为 结直肠癌患者接受EGFR单抗治疗的预测指标。 欧盟药品审评管理局规定：cetuximab 及panitumumab 用于mCRC的治疗前，患者必须确定为K-ras野生型。K-ras与结直肠癌治疗结直肠癌（CRC）缺乏EGFR基因突变对爱必妥单药治疗转移性结直肠癌（mCRC）临床试验中110例活检标本进行的研究未发现 EGFR基因突变（外显子1821） Khambata-Ford S, et al. J Clin Oncol 2007;25:32303237抗EGFR治疗前检测KRAS基因突变的理由避免不必要的不良反应控制不必要的费用确认能够从治疗中获益的野生型患者避免治疗对突变型患者的潜在毒性CHMP gave a positive opinion for ERBITUX May 29, 2008 but for patients with wild-type KRAS tumors810名胃癌病人有HER2基因的扩增，约占参与实验总人数的2