流式细胞仪分析技术及应用高瀛岱

1、流式细胞术的特点流式细胞术的特点细胞不被破坏，测量快速、大量、准确、灵敏、定量流式细胞术最大的特点是能在保持细胞及细胞器或微粒的结构及功能不被破坏的状态下，通过荧光探针的协助，从分子水平上获取多种 信号对细胞进行定量分析或纯化分选。1.流式细胞仪的基本结构：1.流式细胞仪的基本结构：液流系光学系数据处理系细胞分选细胞分选原理通过流式细胞仪进行细胞分选主要是在对具有某种特征的细胞进一步培养和研究时进行（一）分选基本原理细胞悬液形成液流柱压电晶体产生机械振动室振动（一）分选基本原理细胞悬液形成液流柱压电晶体产生机械振动室振动液流断裂成液滴空白液滴含细胞的液滴不充电充弃偏转落入收集器（二）分选的技术

2、要求分选速度：时间内分选的细胞数量。与（二）分选的技术要求分选速度：时间内分选的细胞数量。与液中细胞的含量分选纯度：分选出的目的细胞占所有收获细胞的百分率。分选收获率：测量点的分选细胞之间的比率。与纯度成反比。分选得率：胞的总量，再经分选后得到目的细胞的实际得率。与分选速度成反比。第二数据的显示与分析参数数据显示方第二数据的显示与分析参数数据显示方式（单参数直方图、参数散点图、二维等高图、假三维等高图、三参数散点图）设门分析技术一参FS：反映颗粒的大小一参FS：反映颗粒的大小SS结构复杂程FL：反映颗粒被染上的荧光数量多少二、数据显示方式二、数据显示方式直分析方图单参数直方图双参数直方图:点图

3、三参数直方图多参数分析设门分析:REGION和GATE设置（一）单参数直方由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数（一）单参数直方由一维参数(散射光或荧光)与颗粒计数，反映同样散射光或荧光强度的颗粒 细胞相对数量 细胞相对数量（二）双参数（二）双参数直方双参数直方图：纵轴和横轴分别代表被测量细胞的两个测量参数，根据这两个参数就双参数信号通常采用对数信号，最常用的 是点密图，在图中，每个点代表一个细胞，点图利用颗粒密度反映同样散射光或荧光强度的颗粒数量的多少。1.双参数直方图点图红色荧光强度1.双参数直方图点图红色荧光强度2. 由类似地图上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图2. 由类似地图

4、上的等高线组成，其本质也是双参数直方图。等高图上每一条连续曲线上具有相同的细胞所代表的细曲线层次越高(越里面的线)数愈多。等高线越密集则表示细胞数变化率越大。二维等二维等高图 3. 假三3. 假三维等（三）三（三）三参数直方（四）流式细胞（四）流式细胞仪的多参数分析多参数分析：当细胞标记了多色荧光，被激发光激发后，得到的荧光信号和散射光信号可根据需要进行组合分析三、设门分析技术Gate设三、设门分析技术Gate设置：指在某一张选定参数的直方图上，根据该图的细胞群分布选定其中想要分析的特定细胞群，并要求该样本所有其他参数组合的直方图只体现这群细胞的分布情况。A淋巴细胞单A淋巴细胞单核细胞 中性粒

5、细胞A、B、C均为任意门线性线性第四流式细胞仪免疫分析的技术第四流式细胞仪免疫分析的技术要样标记染色液相质量控制技术一、免疫检测样品单细胞悬液外巴细胞样品的一、免疫检测样品单细胞悬液外巴细胞样品的分离单个核细培养细胞的样品使贴壁细胞脱落蛋白酶洗机械吹尼龙网新鲜实体组织单细胞悬液的机械法酶处理法化学试剂处理法表面活新鲜实体组织单细胞悬液的机械法酶处理法化学试剂处理法表面活性剂处理法单细胞悬液的保存深低温保存法（一年乙醇或甲醇保存法（2周或多聚保存法（2月Sorting1%Sorting1%Fetalrum(Heat- 1PhosphateBufferSalineorHBSS (Ca/Mg+ fr

6、ee)1mM25mMHEPESpH高本Sortingbuffer加5mMMgCl2以及2550DNAaseI(SigmaD-4513)或是Sortingbuffer加0.83mM MgCl2以及高本Sortingbuffer加5mMMgCl2以及2550DNAaseI(SigmaD-4513)或是Sortingbuffer加0.83mM MgCl2以及20 U DNAase II (Sigma D-4138)。这些 方出來的DNA所 成的细胞黏聚现象(Adherent以Trypsin处 后去准备单细胞悬液时，待细胞变 (不可过度作用)，便以5 ml 含离心后，用sortingbuffer调整细

7、胞浓度 如果需要的话，可以提高EDTA的浓度(至 二、常用的与标记染尽 选择荧光光谱重PE-Cy5/APC&二、常用的与标记染尽 选择荧光光谱重PE-Cy5/APC&PerCP-CD62Lon扰联APC-Cy7/PE-2Minimizethepotentialforspectral2MinimizethepotentialforspectralSpilloverestimateshespectra（一）几种常见的荧细异酸（一）几种常见的荧细异酸荧激Texas 得州能量传递复 常用的几类荧光名波溶解特异硫 酸荧绿易敏易溶于水，与抗体结合不影响特异性得州红 常用的几类荧光名波溶解特异硫 酸荧绿易敏

8、易溶于水，与抗体结合不影响特异性得州红不不敏橙易不敏光系数和量子产额高红能量传递复红易不敏减少交叉，成本高能量传递复合用化学法将两种不同激发波长的结合在一能量传递复合用化学法将两种不同激发波长的结合在一起，在488nm激发光照射下，通过一个荧被激发后产生的发另一荧产生荧光信号，从而测到该特定荧光信号。能量传递复机能量传递复机藻红蛋花青苷血液系血液系统单细胞分选标准化的建立背干细胞的研究背干细胞的研究意义现在已经越来越重要越来越显示干细胞自我更新及化的分子机制都是在单细胞水平上发生的细组及表观遗传学分析、免疫缺拟解决的关键科学问题所有的拟解决的关键科学问题所有的单细胞实验技术中，干细胞的单胞分选

9、是最为关键，也是最为基础的一环节。影响单细胞分选效果有很（比如目的分离细胞群的不同，分选的器选的选择，不同光颜色之间的补偿计算，样品的准备，集工具的不同单细胞分选的标准化建立非常重要，尤我研究对研究工作主要以血液系统更加有意义研究目通研究目通过对机器参数的调整，激光功确认，补偿的量化处理，接收工具的模研究方荧光抗体的选择研究方荧光抗体的选择分选仪器的比较补偿计算的量化精确调整接收工具的模板标准化单细胞的培养鉴定荧光抗体荧光抗体的选择正常造血干细胞分选标记：Lin-CD45RA-白血病干细胞的分选标记：CD34+CD38-CD90-CD117-正常造血干细胞分选标记Lin-Sca-1+c-Kit

10、+CD34- Flk2- 或者 Lin-Sca-1+c-Kit+CD150+CD48-MLL-AF9AML白血病干细胞的分选标记Lin- Sca-1-c-Kit+ CD16/32+CD34+ c-Kit+Gr-1-BCR-ABLCML白血病干细胞的分选标记Lin- 分选仪器的比较石英分选仪器的比较石英杯激发空气激发补偿计算补偿计算的量化精确调整补偿微球（comp-beads），标阳补偿管，进行上样通过圈接收工具的模板接收工具的模板标准化因为实验的需求不同，所以单细选到不中，这其中包括24孔板96孔板，72孔板乃至384孔板等，在每个器上调整相应模板，使其固定为标准化单细胞的培养鉴将单细胞的培养鉴将分好的单细胞至于相应的培养进行14天培养，培养后对每板细胞存活1IMDM + 10%FBS+ SCF100ng/mL TPO50ng/mL+ Flt3L14技术路技术路CD34