牙龈卟啉单胞菌诱导人白细胞脱颗粒的体外观察

1、牙龈卟啉单胞菌诱导人白细胞脱颗粒的体外观察【摘要】目的研究牙龈卟啉单胞菌及其可溶性毒力因子对人多形核白细胞的影响，讨论其导致慢性牙周炎发生的作用机制。方法采集安康中老年人外周血，利用透射电镜观察多形核白细胞培养组对照组与牙龈卟啉单胞菌超声粉碎滤液共同培养组实验组多形核白细胞脱颗粒现象。结果实验组多形核白细胞发生明显的形态学变化，而对照组细胞无明显变化；实验组脱颗粒白细胞百分数较对照组显著增多P0.001。结论牙龈卟啉单胞菌可诱导多形核白细胞中颗粒向细胞周边挪动并脱出，从而降低宿主的免疫才能,在慢性牙周炎发生中具有重要作用。【关键词】牙龈卟啉单胞菌；多形核白细胞；细胞脱颗粒慢性牙周炎在中老年人中

2、的患病率极高，是导致中老年人群牙齿缺失的主要原因。牙龈卟啉单胞菌Prphyrnasgingivalis，P.g是慢性牙周炎重要的可疑致病菌之一1，可通过其可溶性产物对牙周组织造成损伤，而多形核白细胞plyrphnulearleukytes，PNLs是机体抵抗病菌入侵的第一道防线2。在牙周炎发病过程中，宿主自身抵抗力的差异性是一个重要的因素，PNLs的功能正常与否，直接关系着机体免疫力的上下。研究发现：牙周致病菌与PNLs的互相作用在牙周病的致病机制中起重要作用3，4。目前针对P.g可溶性毒力因子对PNLs影响的系统研究较少，本研究旨在通过观察P.g超声滤液诱发PNLs脱颗粒的形态变化，讨论P.

3、g可溶性毒力因子对PNLs的影响。1材料与方法1.1细菌菌种与研究对象P.g标准菌株AT33277购自上海市口腔医学研究所。选择10例安康老年人为试验对象，男女各5例，平均年龄605岁，所有受试者均知情同意。受试者的选择标准包括：无全身性疾病；近3个月无服用抗生素类药物；无活动性龋，牙周安康。1.2方法1.2.1细菌的培养及超声滤液的制备将P.g接种在血液琼脂培养基中营养琼脂加10%新颖兔血，10%2的厌氧环境，37培养24h。将生长良好的细菌用生理盐水洗下，配置成2单位麦氏比浊管的浓度6108FU/l，将该浓度的细菌置超声仪中超声粉碎PG115型超声破碎仪，德国SE公司，取上清进展过滤，滤过

4、液置4保存备用。1.2.2外周血PNLs的别离培养取10例安康老年人静脉血20l，肝素抗凝后，用不连续密度梯度Perll别离PNLs。先将70%浓度Perll溶液缓慢参加试管中，再加50%浓度的Perll溶液，使之形成满意的界面。加抗凝血约1.5l后离心25in，收取多形核细胞层，将细胞用不含血清的培养液洗涤2次，用含10%胎牛血清的RPI1640培养液制成细胞悬液5106/l，37，5%2孵箱中培养24h。1.2.3细菌超声滤液作用于PNLs随机分为两组，实验组在PNLs内参加P.g超声粉碎滤液200l，对照组的PNLs内参加RPI1640培养液。在0、10、30和60in4个时间段进展电镜

5、观察。1.2.4透射电镜样品的制备1.3统计学分析用SPSS11.5统计软件进展数据分析。采用成组设计两样本均数比拟t检验。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1P.g超声滤液诱发PNLs脱颗粒的形态变化电镜观察显示：对照组中各时间点PNLs形态完好，细胞浆内无明显颗粒，细胞膜边缘整齐，细胞核呈分叶状、饱满图1A。而实验组中PNLs在P.g超声滤液作用10in时，细胞内有明显的颗粒聚集并向细胞周边挪动的现象图1B，在30和60in时，PNLs出现脱颗粒现象，同时伴有细胞不完好，细胞膜不光滑，细胞核皱缩的现象细胞凋亡出现，甚至出现细胞裂解死亡图1、1D。2.2脱颗粒的PNLs与正常PNLs百分数的比

6、拟P.g的超声滤液参加PNLs后在0、10、30、60in4个时间点利用电镜观察。结果显示：在10、30和60in3个时间点变现出差异，实验组在10in时脱颗粒的PNLs增多，在之后的时间里得到了持续，而对照组波动较实验组稳定。见表1。表1两组脱颗粒的PNLs数略3讨论老年人的牙周附着丧失重于年轻人，慢性牙周炎多见于中老年人。牙龈卟啉单胞菌是目前公认的牙周致病菌之一，也是牙周微生物领域重点研究的厌氧菌之一，与慢性牙周炎、侵袭性牙周炎、牙周脓肿和牙髓感染以及伴发性全身性系统疾病亲密相关5，6。病原菌致病是一个多因素共同作用的过程，有参与根本生理过程的看家基因和多种毒力基因参与。P.g基因的多态性

7、与复杂性使得其致病机制迄今尚不明了，已发现的P.g的毒力因子包括菌毛、牙龈素、脂多糖LPS等7，8。PNLs是机体免疫防御系统的重要组成部分，既是白细胞中功能最活泼的多功能细胞，也是参与炎症反响的主要细胞。PNLs具有吞噬作用，可以在感染组织中迁移,预防炎症的扩散，是细胞免疫和体液免疫的积极参与者，主要通过释放多种蛋白水解酶而发挥杀菌功能9。当PNLs不能正常行使其功能时，细菌不仅不会被杀死，而且可以抑制溶酶体和吞噬体的交融。即便是PNLs的吞噬才能正常，但对趋化性反响迟钝，不能游走至趋化因子刺激的部位，会使感染经久不愈。PNLs的杀菌作用主要依赖于吞噬溶酶体中颗粒成分所调节的非氧化机制。颗粒

8、成分的细胞外释放可能抵消PNLs内杀伤作用，降低部分的免疫防御功能和屏障作用。导致溶酶体成分细胞外分泌的主动过程为细胞支架的聚合，它是颗粒向细胞周边的转运机制9。此外，脱颗粒将导致牙周组织内溶酶体混合成分浓度的增加，它不仅有害于宿主细胞，而且还可以参与牙周组织的病理过程加剧炎症反响10。将P.g用超声波粉碎机粉碎，滤液内会含有该菌的绝大部分可溶性毒力因子。研究这种滤液既可以防止菌体本身的不确定性又能防止单一成分的不完好性，是一种方便、可靠的有效途径4。本实验将P.g超声粉碎滤液与安康中老年人外周血中的PNLs共同培养,结果发现：实验组(在PNLs中参加P.g超声粉碎滤液)和对照组(在含抗毒血清的PNLs中参加P.g超声粉碎滤液)存在显著差异，实验组脱粒的PNLs百分数明显高于对照组，同时随时间的延长，脱颗粒现象更加明显。本研究认为，P.g的超声粉碎滤液可以使安康中老年人外周血中的PNLs发生脱颗粒，从而通过降低宿主的免疫功能导致牙周