微生物工程教案

1、-. z.微生物工程教案授课教师：爱梅西北师大学生命科学学院2013年4月课程名称微生物工程课程代码74022718学分2总学时36理论学时36课程性质根底课 专业必修课 专业限选课 专业任选课 教学手段多媒体任课教师爱梅职称副教授授课时间20122013学年第一学期授课对象2010级生物技术1班教 学目的与要 求通过系统地讲授微生物工程的原理、方法、生产设备、应用及进展，使生物技术专业类的学生对微生物工程的最新成就、原理和生产方法等有较全面地了解，扩大学生眼界，使其能够更加适应市场经济的需要。通过本课程的学习使学生将理科的有关知识与必要的工程技术有机的结合起来，使学生既能掌握比拟专业的理论知

2、识，又能掌握工程技术方面的根本计算和设计工艺流程的原理和方法。教 学基 本要 求掌握微生物工程的根本原理及规律，熟悉微生物工程生产的常用设备，使学生既学到比拟专业的微生物学理论知识，又掌握工程技术方面的根本计算和设计工艺流程的原理和方法。教 材军卫主编微生物工程第二版主要参考资料微生物工程 (吴松刚 科学 2004微生物工程工艺原理 (汝华) 华南理工大学 2005新编生物工艺学 俞俊棠 化学工业 2003发酵工艺原理 熊宗贵 中国药科大学 2000发酵工程与设备 邱立友 中国农业 2007现代生物工艺学 储炬 华东理工大学 2008微生物发酵过程多尺度研究与优化 嗣良 化学工业 2003 F

3、ermentation Microbiology and Biotechnology (E. M. T. El-Mansi, C. F. A. Bryce, Arnold L. Demain ) Taylor & Francis 2011院系审阅意见系主任签字： 年 月 日教学容与学时分配 教学时数教学容讲课实验小计备 注绪论2学时2学时实验课单独开设第一章 菌种的来源2学时2学时第二章 优良菌种的选育2学时2学时第三章 菌种保藏的原理及方法1学时1学时第四章 微生物的代调节和代工程3学时3学时第五章 微生物发酵培养基2学时2学时第六章 发酵工艺控制8学时8学时第七章 发酵过程的参数检测2学时

4、2学时第八章 微生物反响动力学3学时3学时第九章 培养基灭菌及灭菌设备3学时3学时第十章 发酵设备3学时3学时第十一章 发酵设备过程的优化与放大概论2学时2学时第十二章 空气除菌设备2学时2学时第十三章 微生物工程展望1学时1学时绪论1.1 发酵及发酵工程一. 发酵的定义1，发酵一词的来源发酵Fermentation一词是拉丁语沸腾fervere的派生词，它描述酵母作用于果汁或麦芽浸出液时产生气泡的现象。产生气泡的现象是由浸出液中的糖在缺氧条件下降解而产生的二氧化碳所引起的。2，狭义 发酵的定义在生物化学或生理学上发酵是指微生物在无氧条件下，分解各种有机物质产生能量的一种方式，或者更严格地说，

5、发酵是以有机物作为电子受体的氧化复原产能反响。如葡萄糖在无氧条件下被微生物利用产生酒精并放出二氧化碳。同时获得能量，丙酮酸被复原为乳酸而获得能量等等。3，广义 发酵的定义工业上所称的发酵是泛指利用生物(微生物或动植物)细胞制造或生产*些产品的过程，它包括厌氧培养的生产过程，如酒精、丙酮丁醇、乳酸等，以及通气有氧培养的生产过程，如抗生素、氨基酸、酶制剂等的生产。产品既有细胞代产物，也包括菌体细胞、酶等。4，发酵工程的定义1国际纯粹及应用化学联合会(1981年)将生物化学、生物学、微生物学和化学工程应用于工业生产过程包括医药卫生、能源及农业产品及环境保护的技术2.国际经济及合作开展组织(1982年

6、)应用自然科学及工程学原理、依靠生物作用剂Biological agents的作用将物料进展加工以提供产品或为社会效劳的技术3. Murry Moo-Young1985年对生物作用和生物物料加以评价和利用，并进展工业产品生产的技术4. Higgins生物系统或生物过程的工业利用，它很大程度上取决于对生物系统及其催化作用专门知识的认识。发酵工程Fermentation Biotechnology应用微生物学等相关的自然科学以及工程学原理，利用微生物等生物细胞进展酶促转化，将原料转化成产品或提供社会性效劳的一门科学。发酵过程的组成局部1发酵过程的组成繁殖种子和发酵生产所用的培养基组份确定；培养基、

7、发酵罐及其附属设备的灭菌；培养出有活性、适量的纯种，接种入生产的容器中；微生物在最适合于产物生长的条件下，在发酵罐中生长；产物提取和精制；过程中排出的废弃物的处理。3发酵生产的条件*种适宜的微生物保证或控制微生物进展代的各种条件培养基组成，温度，溶氧pH等进展微生物发酵的设备提取菌体或代产物，精制成产品的方法和设备发酵工程的地位1. 生物工程重要的组成局部发酵工程( Fermentation )酶工程 (蛋白质工程) (Enzyme engineering & Protein engineering) 基因工程 ( Genetic engineering) 细胞工程 ( Cell engine

8、ering )2. 生物工程中其他技术产业化表达的重要手段基因工程菌动植物细胞培养3. 生命科学研究的对象或载体地位基因工程细胞工程酶工程发酵工程二发酵工程的特点发酵和其他化学工业的最大区别在于它是生物体所进展的化学反响。其主要特点如下：1发酵过程一般来说都是在常温常压下进展的生物化学反响，反响平安，要求条件也比拟简单。2发酵所用的原料通常以淀粉、糖蜜或其他农副产品为主，只要参加少量的有机和无机氮源就可进展反响。微生物因不同的类别可以有选择地去利用它所需要的营养。基于这特性，可以利用废水和废物等作为发酵的原料进展生物资源的改造和更新。3发酵过程是通过生物体的自动调节方式来完成的，反响的专一性强

9、，因而可以得到较为单的代产物。4发酵过程中对杂菌污染的防治至关重要。除了必须对设备进展严格消毒处理和空气过滤外，反响必须在无菌条件下进展。如果污染了杂菌，生产上就要遭到巨大的经济损失，要是感染了噬菌体，对发酵就会造成更大的危害。因而维持无菌条件是发酵成败的关键。5由于生物体本身所具有的反响机制，能够专一性地和高度选择性地对*些较为复杂的化合物进展特定部位地氧化、复原等化学转化反响，也可以产生比拟复杂的高分子化合物。6微生物菌种是进展发酵的根本因素，通过变异和菌种筛选，可以获得高产的优良菌株并使生产设备得到充分利用，也可以因此获得按常规方法难以生产的产品。7工业发酵与其他工业相比，投资少，见效快

10、，开可以取得显著的经济效益。三、发酵的类型1按发酵原料来区分糖类物质发酵石油发酵废水发酵2按发酵形式来区分固态发酵深层液体发酵3按发酵产物区分氨基酸发酵有机酸发酵抗生素发酵酒精发酵维生素发酵酶制剂发酵4按发酵工艺流程区分分批发酵连续发酵流加发酵5按发酵过程中对氧的不同需求来分厌氧发酵通风发酵发酵产品的类型工业上的发酵，有四个主要类别：一、菌体工业生产的微生物体，可分为二种：1供制备面包用的酵母；2作为人类或动物的食物的微生物细胞单细胞蛋白质。二、微生物的酶工业上，曾由植物、动物和微生物生产酶。微生物的酶可以用发酵技术大量生产，是其最大的优点。而且与植物或动物相比，改进微生物的生产能力也方便得多

11、。酶的生产是受到微生物本身严格控制。为改进酶的生产能力可以改变这些控制，如在培养基中参加诱导物和采用菌株的诱变和筛选技术，以消除反响阻遏作用。三、微生物代产物1代产物的类别初级代产物：氨基酸、核苷酸、蛋白质、核酸、脂类和碳水化合物等。次级代产物：有些微生物的稳定期培养物中所含有的化合物，并不在营养期时出现，而且未见到对细胞代功能有明显的影响。例如，抗生素。2初级代产物及其在工业上的应用1第一个阶段19世纪以前产品只限于含酒精饮料和醋古埃及已经能酿造啤酒2第二个阶段1900年1940年主要的新产品是酵母、甘油、柠檬酸、乳酸、丁醇和丙酮在面包酵母的生产中首先采用了分批补料培养技术在一次大战时，We

12、izmann开拓了丁醇丙酮发酵，并建立了真正的无杂菌发酵3第三个阶段1940年以后这以阶段的标志是，在纯种培养技术下，以深层培养生产青霉素解决向培养基入大量无菌空气和高粘度培养液的搅拌问题4第四个阶段1960年以后以烃为碳源生产微生物细胞作为饲料蛋白质的来源出现了不需要机械搅拌的高压喷射和强制循环的发酵罐工业上普遍采用分批培养和分批补料培养法5第五个阶段1979年以后这个阶段以基因工程产品的生产为标志。目前，世界上已经批准上市的基因工程药物就有几十种，如：胰岛素、人生长激素等等。3工业化成功利用催化生产的有机化合物4微生物酶促转化与化学合成有机结合5，现代生物技术的开展1.2 发酵工程的应用一

13、发酵工程在食品,轻工业领域的展望高产菌种和特殊环境微生物的遗传育种新酶品种开发和应用食品添加剂新品种开发和应用生物技术产物工业规模的别离和提取二发酵工业围1. 酿酒工业(啤酒、葡萄酒、白酒等)2.食品工业(酱、酱油、醋、腐乳、面包、酸乳等)3.有机溶剂发酵工业(酒精、丙酮、丁醇等)4.抗生素发酵工业(青霉素、链霉素、土霉素等)5.有机酸发酵工业(柠檬酸、葡萄糖酸等)6.酶制剂发酵工业(淀粉酶、蛋白酶等)7. 氨基酸发酵工业(谷氨酸，赖氨酸等)8. 核苷酸类物质发酵工业(肌苷酸、肌苷等)9. 维生素发酵工业(维生素、维生素等)10.生理活性物质发酵工业(激素、赤霉素等)11.微生物菌体蛋白发酵工

14、业(酵母、单细胞蛋白等)12.微生物环境净化工业(利用微生物处理废水、污水等)13.生物能工业(沼气、纤维素等天然原料发酵生产酒精、乙烯等，能源物质)14.微生物冶金工业(利用微生物探矿、冶金、石油脱硫等)三发酵产品的应用领域1，医药2，食品3，化工4，纺织5，轻工6，环保四发酵罐等生物反响器规模谷氨酸 100200m3 最大660m3啤酒 600m3露天柠檬酸 220m3酶制剂 90m3 酵母培养罐 170m3黄酒 200m3酒精 51500m3五国外发酵工业的开展趋势1生物转化或生物合成技术成为国外著名化学公司争夺的热点，并逐步从医药领域逐渐向化工领域转移2生物催化合成已成为化学品合成的支

15、柱之一3利用生物技术生产有特殊功能、性能、用途或环境友好的化工新材料，是化学工业开展的一个重要趋势。4传统的发酵工业已由基因重组菌种取代或改进。许多传统的发酵工程产品如柠檬酸、青霉素等都已开场采用基因工程手段进展改造，大提高了产量。在以基因工程为主导的现代生物技术产品中，医药生物技术产品占75左右。六国发酵工业的开展概况我国传统发酵历史悠久，在黄帝经素向、汤液醪醴论里，已有酿酒的记载。白酒的起源，当在元朝以前，尚待考证。酱油的酿造，当始自周朝。在汉武帝时代开场有了葡萄酒，距今已有两千多年的历史。数千年来由于科学技术进步缓慢，各种微生物工业也未能充分开展。直到20世纪中期才建立了一系列新的微生物

16、工业。近几年来，由于生物新技术的应用，发酵工业开场进入新的开展时期。1白酒中国的酿酒业，距今已有数千年的历史渊源。白酒是我国特有的、具有悠久历史的传统酒种。1949年新中国成立时，我国白酒的产量只有108万t 。1996年，我国白酒产量到达历史顶峰，总量到达80130万t。目前，我国白酒的产量为400余吨。2黄酒黄酒是我国最古老的酒种，早在夏、商、周三代就已经大量生产了，并流传至今，据史料记载已有6000年左右了。目前年产量为130万吨左右。3啤酒1900年我国最早的啤酒厂于建成1915年国人投资的双合盛啤酒厂建成1949年啤酒产量仅七千余吨1981年啤酒产量增至91万吨2001年产量到达22

17、00万吨左右4葡萄酒1892年华侨弼士在建立酿酒公司，这是我国第一个新型的葡萄酒酿造厂目前我国葡萄酒工厂已有近八十家葡萄酒年产量约30万吨裕、王朝、长城三家公司占据50.6的市场份额，销售收入占整个行业的61.95酱油和醋早在三千年前便已掌握了酱油和醋发酵的技法，数千年来一直沿用自然发酵法，直到20世纪后才开场采用纯种培养培养技术生产，目前设备及酿造方法逐步实现了现代化酱油年产量约为450万吨，已居世界首位醋年产量约为250万吨6酒精二十世纪初期，外商在东北设立和两个酒精厂1922年溥益酒精厂成立，为第一个由国人设立的酒精厂1934年华侨投资在浦东设立中国酒精厂，当时号称远东第一大型酒精厂酒精

18、年产量解放前仅1万吨左右。7酶制剂1964年才在建立了第一个酶制剂工厂目前有酶制剂生产厂家40家左右，其中万吨以上，销售额2000万以上有8家，其余均在万吨以下目前的年产量为22万吨左右8柠檬酸1953年我国曾进展浅盘发酵制柠檬酸的中型生产1965年前后由酵母厂首先采用深层发酵法，由薯干直接发酵生产柠檬酸生产能力为35万t/a，实际产量达25万t/a左右，出口量居世界第一位9.微生物制药在建立了第一个抗生素工厂(即后来的第三制药厂)，以生产青霉素为主1958年我国最大的抗生素工厂华北制药厂亦正式投入生产10味精1964年我国谷氨酸发酵研究成功，首先在投入生产味精生产万吨以上产量的工厂有17家最

19、大规模是莲花味精集团公司，年产12万吨目前年产量60多万吨11基因工程产品至1998年，已有14种基因工程药物、3个基因工程疫苗和数十个重组诊断试剂投放市场12细胞工程产品紫草、三七等等植物细胞已可在发酵罐种大规模培养。我国的传统中药涉及5000种左右植物，细胞培养是中药资源开发的一个重要方面。七我国发酵工业的主要进步1.发酵产品增长快、质量明显提高，在国民经济中起重要作用新型发酵工业：年产量115万吨；产值150亿；利税50亿。酿酒工业不包括酒精：年产量2000万吨左右；产值450亿；利税120亿。2.科技进步，技术水平提高例如：糖化酶的发酵液酶活力由7000 uml提高至30000-400

20、00 uml；味精和柠檬酸三个主要指标：产酸率、转化率和提取率提高5%左右。3.积极开发新产品特鲜味精；无水柠檬酸、柠檬酸盐；高温-淀粉酶；纤维素酶； -葡聚糖酶；异淀粉酶等酶制剂；L一苹果酸；L一乳酸；衣康酸；黄原胶;功能性发酵制品: r-亚麻酸；冬虫夏草；蘑菇、灵芝多糖; 活性肽；红曲色素, 低聚异麦芽糖、果糖、半乳糖、木糖；海藻糖等等。八与国际先进水平的差距1多数工厂规模小、效益低2生产技术水平比拟低3产品品种单一，构造不合理4应用的深度和广度不够5技术装备和检测手段落后，自动化水平低6综合利用和环境治理差九、参加WTO对我国发酵行业的影响1有利因素主要表现我国参加WTO后，是世贸组织的

21、一个成员，可以同等享受最惠国待遇国民待遇也是世贸组织的一个重要原则参加世贸组织，对企业引进外资和先进技术和先进装备以及管理经历，加速企业改组改造，进展企业构造和产品构造调整，促进企业的进一步开展有利中国参加WTO后，关税进一步降低中国参加WTO后，发酵企业对原料的选择性围宽了2不利因素主要表现：对原料产区形成卖粮难国外先进国家技术水平高，产品质量好、本钱低，对国同类产品冲击较大我国研究力量薄弱，研究手段相对落后，综合素质较差3应对措施：加快技术进步步伐，走创新之路，提高水平，降低本钱调整企业构造和产品构造提高企业领导经营管理水平，加强产品质量管理和产品标准化工作加强国国际之间的技术交流和合作，

22、引进入才、引进外资、引进先进技术和装备发挥各行业的优势和特点，摘出本企业有特色的产品，以提高竞争力发酵工程的重大转折点二十世纪四十年代初，第二次世界大战爆发，青霉素的发现，迅速形成工业大规摸生产。1928年由 Fleming发现青霉素1941年美国和英国合作对青霉素进展生产研究外表培养：1升扁瓶或锥形瓶，装200mL麦麸培养基 40u/ml1943年沉浸培养： 5m3 200u/ml当今：100m3200m3 5-7万u/ml链霉素、金霉素、新霉索、红霉素大型发酵罐搅拌装置180M3发酵罐车间发酵车间的空气过滤器现代生物技术分子生物学与发酵工程氨基酸发酵工业谷氨酸、赖氨酸核酸发酵工业肌苷酸、乌

23、苷酸微生物变异株通过代调节代控制发酵技术切断支路代转折点: 酶的活力调控, 酶的合成调控(反响控制和反响阻遏) 解除菌体自身的反响调节,特殊调节控制的利用,突变株的应用,前体、终产物、副产物等发酵工程产业化开展目前，全球发酵产品的年销售额在400亿美元左右，并以每年约78的速率增长。我国发酵行业生产企业有5000多家，主要发酵产品的年产值高达1300亿元。发酵工程技术给人类社会生产力的开展带来了巨大的潜力21世纪是生物技术世纪未来学家说：21世纪是生物技术世纪；科学家预言： 21世纪世界即将在生物技术上取得重大突破，新世纪之初，科学方面的主要将在生物学、遗传学和医学、新型生物材料、能源、环境保

24、护上有所突破；经济学家则认为：21世纪20年代，生物经济将由目前的形成阶段进入成长阶段，即工业生产与商业开发阶段。1.3 发酵工程的生物学与工程学根底发酵工程的主要问题-过程优化与放大在已提供高产菌株的根底上，如何把这些高产菌种在培养过程中进一步考察它的生理生化特性，稳定或改进微生物反响工艺过程，这里要求对生物物性的动态有详尽的了解，对生化反响做定量的和动力学方面的考察。发酵工程在生物技术产业开展中的地位21世纪的工业生物技术产业，终究是一个什么样的格局？作为工业生物技术核心的发酵工程，在已经开场的生物经济时代，是处于一种什么状态？能起何种作用？又面临那些课题？这是人们所关注的问题！1 .4

25、本课程的学习容通过发酵工程的学习，将技术根底课和专业课与发酵工业的操作原理结合起来，了解发酵工业控制的特性及共性，并且熟悉发酵工业的工艺流程及常用术语，为今后从事生物工程的有关科研和生产打下良好的根底。第二章菌种的来源及选育第一节微生物的特性及工业微生物的要求一.微生物的特性二、发酵工业常用微生物的形态特征1.细菌Bacterium) 1形态2构造3培养特征2.酵母Yeast) 1形态2构造典型构造:细胞壁；细胞膜；细胞核；液泡；线粒体；质网；核糖体；微体；微丝；含物3.霉菌形态4、微生物的特点体积小；种类多；分布广；繁殖快；便于培养；容易发生变异；在生产中不易受时间、季节、地区的限制5、微生

26、物与发酵发酵工程是以微生物的生命活动为中心的微生物的生物学性状和发酵条件决定了其相应产物的生成工业上用的全部微生物都称为工业微生物，工业生产上常用的微生物主要是细菌、放线菌、酵母菌和霉菌由于发酵工程本身的开展以及基因工程正在进入发酵过程，病毒、藻类等其它微生物也正在逐步地变为工业生产菌。三工业化菌种的要求能够利用廉价的原料，简单的培养基，大量高效地合成产物有关合成产物的途径尽可能地简单，或者说菌种改造的可操作性要强遗传性能要相对稳定不易感染它种微生物或噬菌体产生菌及其产物的毒性必须考虑在分类学上最好与致病菌无关生产特性要符合工艺要求第二节 自然界中有目的微生物别离的原则一、菌种别离的一般过程二

27、、采样时要注意的问题三、目的微生物富集的一些根本方法四、菌落的选出第三节 已工业化产品生产菌的介绍一、抗生素生产有关的微生物二、氨基酸生产有关的微生物三、食品酶制剂生产有关的微生物第四节 优良菌种选育一、自然选育二、诱变育种诱变育种的一般步骤 出发菌株 纯化、活化、前培养同步培养 培养液 离心收集细胞、洗涤，制备均一的菌悬液玻璃珠打散、过滤 单细胞或单孢子悬液 活菌计数，诱变预备试验 诱变处理 活细胞计数，致死率计算 后培养中间培养 平板别离 变异率计算 初筛复筛 保藏及扩大试验诱变育种工作中应注意的问题1.平安问题：各种诱变剂几乎都有致癌作用，因此在操作中应时刻注意平安问题：个人平安和环境平

28、安。 个人平安：操作时注意防护，不同诱变剂要求不同防护方法，如-射线辐射防护要求较高，uv要求较低，而化学诱变剂则要求不与身体有关部位直接接触。 环境平安：所用物品要经解毒处理；液体经解毒或充分稀释才可以排放。2. 要养成良好的工作习惯：如仔细观察细微的形态变化、要详实记录菌株的诱变史和诱变谱系。 3. 诱变育种技术要和其他育种手段相结合。 4. 诱变育种由于其筛选的盲目性，突变的不定向性，工作量十分大，因此要对整个工作进展合理的设计并结合新技术提高其工作效率。 第五节 营养缺陷型菌株的筛选营养缺陷型是一种生化突变株，它的出现是由基因突变引起的。遗传信息的载体是一系列为酶蛋白编码的核酸序列，如

29、果核酸序列中的*碱基发生突变，由该基因所控制的酶合成受阻，该菌株也因此不能合成*种营养因子，使正常代失去平衡。在筛选营养缺陷型菌株中，与之有关的培养基有三类：完全培养基：plete Medium CM含有满足*微生物的所有营养缺陷型和野生型菌株生长所需营养物质的天然或半合成培养基。 根本培养基：Minimal MediumMM：不含生长因子仅能满足*微生物的野生型菌株生长需要的最低成分合成培养基。 补充培养基：Supplemented Medium(SM)：补充了一种或数种生长因子，以满足*微生物的特定的营养缺陷型生长的培养基，其中的生长因子多是通过直接添加AA、碱基或维生素而提供。第三章菌种

30、保藏的原理和方法一原理使微生物的代处于最不活泼或相对静止的状态，才能在一定的时间使其不发生变异而又保持生活能力。低温、枯燥、寡营养和隔绝空气二防止菌种衰退的方法控制传代次数选择适宜的培养条件利用不同类型的细胞进展传代选择适宜的保藏方法三菌种保藏法斜面保藏法(传代培养保藏法 )是指将菌种接种于适宜的培养基中，最适条件下培养，待生长充分后，于46进展保存并间隔一定时间进展移植培养的菌种保藏方法。液体石蜡保藏法(矿物油保藏法 )是指将菌种接种在适宜的斜面培养基上，最适条件下培养至菌种长出强健菌落后注入灭菌的液体石蜡，使其覆盖整个斜面，再直立放置于低温46枯燥处进展保存的一种菌种保藏方法。穿刺保藏法1

31、%软琼脂小试管和螺口小管沙土管保藏法将培养好的微生物细胞或孢子用无菌水制成悬浮液，注入灭菌的沙土管中混合均匀，或直接将成熟孢子刮下接种于灭菌的沙土管中，使微生物细胞或孢子吸附在沙土载体上，将管中水分抽干后熔封管口或置枯燥器中于46或室温进展保存的一种菌种保藏方法。真空冷冻枯燥保藏法将微生物冷冻，在减压下利用升华作用除去水分，使细胞的生理活动趋于停顿，从而长期维持存活状态。液氮超低温保藏液氮超低温保藏技术是将菌种保藏在-196的液态氮，或在-150的氮气中的长期保藏方法，它的原理是利用微生物在-130以下新代趋于停顿而有效地保藏微生物。-20低温冷冻保藏将菌种保藏在-20冰箱中以减缓细胞的生理活

32、动进展冷冻的一种保藏方法。四菌种保藏机构CCGMC: AS-1,2,3,4,IVACCC: ISFCICC: IFFICMCC: NICPBP,ID,IVCACC第四章微生物的代调节与代工程第一节 代调节的方式1，细胞透性的调节细胞质膜的透性直接影响物质的吸收和代产物的分泌，从而影响到细胞代的变化。细胞质膜的透性的调节是微生物代调节的重要方式，由它控制着营养物质的吸收。2，代途径区域化 原核微生物细胞构造虽然简单，但也划分出不同的区域，对于*一代途径有关的酶系则集中在*一区域，以保证这一代途径的酶促反响顺利进展，防止了其他途径的干扰。例如呼吸的酶系集中在细胞质膜上；而与蛋白质合成有关的酶系则位

33、于核蛋白体上；分解大分子的水解酶，在革兰氏阴性菌里是位于壁膜间隙中，而革兰氏阳性菌则将这些水解酶类，分泌于胞外。在真核微生物细胞里，各种酶系被细胞器隔离分布。如与呼吸产能有关的酶系集中于线粒体膜上；蛋白质的合成酶系位于核蛋白体上；DNA合成的*些酶位于细胞核里。细胞具有复杂的构造使其代活动只能在特定的部位上进展，即代活动是区域化的，其实质是控制酶与底物接触，使各个反响有序地进展。3，代流向的调控微生物在不同条件下可以通过控制各代途径中*个酶促反响的速率来控制代物的流向，从而保持机体代的平衡。它包括两种形式:由一个关键酶控制的可逆反响由两种酶控制的逆单向反响由一个关键酶控制的可逆反响: 同一个酶

34、可以通过不同辅基(或辅酶)控制代物的流向。例如，谷氨酸脱氢酶以NADP+为辅酶时，主要是催化谷氨酸的合成，当以NAD+为辅酶时，则催化谷氨酸的分解。因此微生物可以通过不同的辅基来控制代物的流向。由两种酶控制的逆单向反响: 逆单向反响是在生物体代的关键部位的*些反响，它是由两种各自不同的酶来催化的。即在一个可逆反响中，其中一种酶催化正反响，而另一种酶则催化逆反响。例如，葡萄糖转化为6-磷酸葡萄糖是由己糖激酶催化的，而其逆反响则是由6-磷酸葡萄糖酯酶催化的。6-磷酸果糖转化为1，6-二磷酸果糖是由磷酸果糖激酶催化的，逆反响则由1，6-二磷酸果糖酯酶催化。4，代速度的调控在不可逆反响中，微生物通过调

35、节酶的活性和酶量来控制代物的流量。微生物在不同条件下能按照需要，通过激活或抑制原有酶的活性或通过诱导或阻遏酶的合成来自我调节其代速度，使之高度经济有效地利用能量和原料进展生长繁殖。二、酶活性的调节1. 概念酶活性调节是指一定数量的酶，通过其分子构象或分子构造的改变来调节其催化反响的速率。2. 酶活性调节的影响因素底物和产物的性质和浓度环境因子(如压力、pH、离子强度和辅助因子等)其他酶的存在3 .酶活性调节的调节方式 激活已有酶的活性- 激活剂 抑制已有酶的活性- 抑制剂 4 .酶活性的调节机制 改变酶分子的活性来调节微生物代速度的方法称为酶活性的调节。其活性发生改变的酶称为调节酶Regula

36、tory enzyme。调节酶也称关键酶，包括变构酶、同功酶和多功能酶，通常为变构酶，一般具有多个亚基，包括催化亚基和调节亚基。微生物体代过程的各种生物化学反响，都是由各种酶来催化的。按各种酶在代调节中作用的不同，又可将酶分为：调节酶(常称关键酶，与代调节关系密切)：包括以下3种： 1)变构酶：一般是具有多亚基四级构造的蛋白质。 2)同功酶：具有同一种酶的底物专一性，但分子构造不同的一类酶。 3)多功能酶：能够催化两种以上不同反响的酶。静态酶：一般与代调节关系不大。 潜在酶：指酶原、非活性型或与抑制剂结合的酶。 一激活激活：在激活剂的作用下，使原来无活性的酶变成有活性，或使原来活性低的酶提高了

37、活性的现象。代调节的激活作用：主要是指代物对酶的激活。前体激活，指代途径中后面的酶促反响，可被该途径中较前面的一个中间产物所促进。代中间产物的反响激活，指代中间产物对该代途径的前面的酶起激活作用。二抑制抑制：由于*些物质的存在，降低酶活性的现象。反响抑制：反响抑制是指代的末端产物对酶(往往是代途径中的第一个酶)活性的抑制。1，无分支代途径的调节通常是在线形的代途径中末端产物对催化第一步反响的酶活性有抑制作用。2，有分支代途径的调节在有两种或两种以上的末端产物的分支合成代途径中，调节方式较复杂，其共同特点是每个分支途径的末端产物控制分支点后的第一个酶，同时每个末端产物又对整个途径的第一个酶有局部

38、的抑制作用，分支代的反响调节方式有多种:酶的顺序反响抑制同工酶的反响抑制协同反响抑制累积反响抑制超相加反响抑制1酶的顺序反响抑制分支代途径中的两个末端产物，不能直接抑制途径中的第一个酶，只有当两个末端产物都过量时，才能对途径中的第一个酶有抑制作用。2同工酶的反响抑制同功酶是指能催化同一生化反响，但它们的构造稍有不同，可分别被相应的末端产物抑制的一类酶。其特点是：途径中第一个反响被两个不同的酶所催化，一个酶被Y抑制，另一个酶被Z抑制。只有当Y和Z同时过量才能完全阻止A转变为B。3协同反响抑制在分支代系统中，几种末端产物同时都过量，才对途径中的第一个酶具有抑制作用，如果末端产物单独过量则对途径中的

39、第一个酶无抑制作用。4累积反响抑制在分支代途径中各种末端产物单独过量时，它们各自能对途径中的第一个反响的酶仅产生较小的抑制作用。一种末端产物单独过量并不影响其它末端产物的形成，只有当几种末端产物同时过量时，才对途径中的第一个酶产生较大的抑制。5超相加反响抑制超相加反响抑制是一种既不同于协同反响抑制又不同于累积反响抑制的作用。对一个分支代途径中，几种末端产物单独过量时，仅产生对共同途径的第一个酶局部的抑制。如果每种末端产物都过量时，其抑制作用则超过各种末端产物单独过量时抑制的总和。 5，酶活性调节的分子机制解释酶活性调节机制的理论：别构调节理论(其核心是酶分子构象的改变)酶分子的化学修饰理论(其

40、核心是酶分子构造的改变)。三、酶合成的调节1.酶合成的诱导： 促进酶的合成.2.酶合成的阻遏： 抑制酶的合成. 包括：1)终产物阻遏。 2)分解代物阻遏。1.酶合成的诱导1).诱导酶:当环境中存在诱导剂时才产生的酶。而这种环境物质促使微生物细胞中酶合成的现象称为酶的诱导。2).组成酶:(p26)-EMP2，酶合成诱导的机制诱导机制: 操纵子学说可以较好的说明酶的诱导产生的机制，操纵子指一组功能上相关的基因，它们由启动基因、操纵基因和构造基因构成。3，酶合成的阻遏1). 末端代产物阻遏End-product repression 这是酶合成阻遏中的一种。它是指由于末端产物的过量积累而引起代途径中

41、酶合成的阻遏，是一种反响阻遏，末端代产物阻遏的特点是同时阻遏合成途径中所有酶的合成。对于分支代途径的末端代产物阻遏，每种末端产物只专一地阻遏合成它自身那条分支途径的酶，而分支点的酶则受所有分支途径末端产物的共同阻遏。这种几个终产物，共同协调阻遏*一个酶的生物合成称为多价阻遏multivalent repression。对于直线式代途径，末端产物阻遏情况较为简单。末端产物将引起代途径中各种酶的合成终止。末端代产物阻遏的机制可以用操纵子学说解释。如大肠杆菌色氨酸操纵子模型。2). 酶合成的分解代物阻遏Catabolite repression 所谓分解代阻遏，是当细胞中具有一优先利用的底物时，很多

42、其他分解反响途径往往受到最容易利用的底物阻遏的现象。由于这种阻遏并不是优先利用底物及作用的结果，而是有底物分解过程中产生的中间代物引起的，所以称为分解代物阻遏。这种阻遏效应最早在1942年由Monod在研究大肠杆菌混合碳源生长时发现。经研究发现，在微生物的生长体系中，外加CAMP环腺苷酸可解除分解代物阻遏，这说明分解代物阻遏的实质是由于细胞缺少CAMP。分解代物阻遏作用是发生在转录水平上的，因而属于转录水平的调节。Monod提出的乳糖操纵子模型可以较好地解释分解代物的阻遏机制。葡萄糖效应 又称葡萄糖阻遏或分解代产生阻遏作用。 葡萄糖或*些容易利用的碳源，其分解代产物阻遏*些诱导酶体系编码的基因

43、转录的现象。如大肠埃希氏菌培养在含葡萄糖和乳糖的培养基上，在葡萄糖没有被利用完之前，乳糖操纵子就一直被阻遏，乳糖不能被利用，这是因为葡萄糖的分解物引起细胞cAMP环腺苷酸含量降低，启动子释放cAMP-CAP蛋白，RNA聚合酶不能与乳糖的启动基因结合，以至转录不能发生，直到葡萄糖被利用完后，乳糖操纵子才进展转录，形成利用乳糖的酶，这种现象称葡萄糖效应。CAP： 降解物激活蛋白 又叫分解代基因活化蛋白catabolite activator protein，简称CAP 。在分解代阻遏中调节基因的产物是降解物基因活化蛋白CAP，它能与 环腺苷酸cAMP结合而被活化，帮助RNA聚合酶与启动子结合，促进

44、转录进展。 4，酶合成阻遏的机制四、能荷调节能荷:指细胞中ATP,ADP,AMP系统中可为代反响供能的高能磷酸键的量度。能荷=(【ATP】+0.5 【ADP】) (【ATP】+ 【ADP】+ 【AMP】) 100能荷= 100全部是ATP能荷= 0全部是AMP能荷= 50全部是ADP (三)、次级代的调节初级代对次级代的调节碳代物的调节作用氮代物的调节作用磷酸盐的调节作用次级代中的诱导作用及产物的反响作用次级代中细胞膜透性调节(四)、次级代物合成的特点次级代物合成过程远较初级代产物复杂；次级代产物则需要复杂的营养条件；在分批培养条件下，次级代产物一般都是在菌体生长的峰值出现后才大量合成。 (五

45、)、常用的提高次级代产物产量的方法 (1) 补加前体类似物 前体：指*些化合物参加到发酵培养基中，能直接被微生物在生物合成过程中合成到产物物分子中去，而其自身的构造并没有多大变化，但是产物的产量却因参加前体而有较大的提高。在合成途径已根本清楚的条件下，向发酵培养基中补加前体是增加次级产物的有效方法。如青霉素G的生产中，苯乙酰-CoA是限速性因子，补加苯乙酸或其衍生物都能增加青霉素G的产量。 次级代产物形成中并不是所有前体类似物都是限制性因子。参加前体提高产量的效果更取决于总体代的调节水平。前体物质本身是否易于得到等。这都是在生产应用中需综合考虑的。 (2) 参加诱导物把一些对次级代产物产生有诱

46、导作用的物质参加发酵培养基中会增加产量。如加蛋氨酸或硫脲可使顶头孢霉增产头孢霉素C，参加巴比妥可提高利福霉素产量等。但在工业生产中还未普遍应用此技术，而只是在选择培养基组成时给以考虑。 目前工业用微生物酶多数为诱导酶，如蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等。诱导物的存在能大大强化诱导酶的生物合成。酶的正常底物或底物的类似物都可作为诱导物。(3) 防止碳分解代阻遏或抑制的发生青霉素发酵中限量流加葡萄糖(或糖蜜)以减少碳分解阻遏的发生，是一项很有效的提高产量的方法。 使用寡糖、多糖等缓慢利用的碳源，葡萄糖与麦芽糖、葡萄糖与蔗糖、葡萄糖与淀粉混合碳源的利用，也都能减少碳分解阻遏的发生。参加影响糖代的硫氰酸苄酯

47、可使金霉菌对葡萄糖的利用速度减缓，可增加金霉素的产量。(4) 防止氮代阻遏的发生防止使用高浓度的铵盐做氮源以防止氮代阻遏的发生，是抗生素发酵工业生产中比拟成熟的经历。在抗生素产生期如补加氮源则会造成发酵逆转，返回生长期，抗生素的产量会大为减少。使用亚适量(对菌体生长)的磷酸盐，亦是抗生素发酵工业中遵循的原则之一。 为防止碳、氮、磷分解阻遏的发生，应选用黄豆饼粉、蛋白胨类、淀粉类物质为主要原料，而尽量少用易被迅速利用的葡萄糖等。 (5) 筛选耐前体或前体类似物的突变株参加前体有提高次级产物产量的效果；但过量对菌体又会有毒。筛选对前体有抗性的突变株以减少或消除前体的反响阻遏，从而可获得高产。如抗苯

48、乙酸的青霉突变株，其青霉素的产量会增加。半胱氨酸、缬氨酸是-酰胺类抗生素的前体，筛选上述氨基酸的类似物，三氟亮氨酸、DL缬氨酸的抗性菌株，其-酰胺类抗生索产量会提高。(6) 选育抗抗生素突变株链霉素、氯霉素、金霉素筹多种抗生素都具有抑制产生自身菌体蛋白质的能力。一株高产抗生索产生菌，必然应具备对自身所分泌的抗生索的抗性。筛选抗抗生素产生菌也就成了菌种选育中的常用方法。金霉素、链霉素产生菌的抗性菌株产量有数倍增加的实验室结果已有不少报道。 (7) 筛选营养缺陷型的回复突变株次级代产物都来自初级代产物，因此其营养缺陷型的产量一般都很低，但其回复突变型中却有不少获得高产的例子，其机制尚不清楚，估计是

49、次生产物或其前体合成的反响抑制被解除。在金霉素产生菌选育中，运用此方法曾获得高产菌株。 (8) 抗毒性突变株的选育重金属离子、羟胺类物质对-酰胺类抗生素产生菌有毒，但与抗生素相结合可解毒。选择适当浓度的此类毒性物质使其恰好抑制产生菌生长，在此条件下能生长的菌株，应为抗生素类物质过量产生的突变株。曾由头孢霉素C对重金属离子的抗性突变株中选育到高产菌株。 有些种类的发酵生产对金属离子相当敏感，因为有些金属离子是中间代酶的抑制剂或激活剂。因此对于有重大影响的金属离子必须严格控制。如柠檬酸发酵中铁、锰和锌离子都能明显影响产量，钙离子对细菌淀粉酶的生产有促进作用，而钴离子对葡萄糖异构酶的发酵是必需的，这

50、些在培养基配制时都必须予以注意。小结：以上主要是从微生物的代调节机制出发探讨获得代产物过量生产的方法。但是，微生物代产物特别是次级产物形成的途径和调节控制机制是相当复杂的，研究得比拟清楚的只是少数。因此，上述方法的应用往往也是经历性的。 在生产实践中为提高微生物产品产量和品质经常使用的方法是诱变后随机筛选和发酵条件的优化。近年来运用遗传工程的方法以获得代产物的过量生产是很活泼的研究领域。第五章培养基培养基medium是人工配制的,适合微生物生长繁殖或产生代产物的营养基质。无论是以微生物为材料的研究,还是利用微生物生产生物制品,都必须进展培养基的配制，它是微生物学研究和微生物发酵工业的根底。一、

51、 配制培养基的原则1. 选择适宜的营养物质总体而言,所有微生物生长繁殖均需要培养基含有碳源、氮源、无机盐、生长因子、水及能源,但由于微生物营养类型复杂,不同微生物对营养物质的需不一样的,因此首先要根据不同微生物的营养需求配制针对性强的培养基。自养型微生物能从简单的无机物合成自身需要的糖、脂类、蛋白质、核酸、维生素等复杂的有机物,因此培养自养型微生物的培养基完全可以(或应该)由简单的无机物组成。例如,培养化能自养型的氧化硫硫杆菌(Thiobacillus thioo*idans)的培养基组成见表4-10。在该培养基配制过程中并未专门参加其他碳源物质,而是依靠空气中和溶于水中的CO2为氧化硫硫杆菌

52、提供碳源。表4-10 几种类型培养基组成成份氧化硫硫杆菌培养基大肠杆菌培养基牛肉膏蛋白胨培养基 高氏一号合成培养基查氏合成培养基 LB培养基 主要作用牛肉膏5 碳源能源、氮源、 无机盐、生长因子蛋白胨1010 氮源、碳源能源、生长因子酵母浸膏5 生长因子、氮源、碳源能源葡萄糖5 碳源能源蔗糖30碳源能源可溶性淀粉20碳源能源CO2来自空气碳源 NH42SO4 0.4 氮源、无机盐NH4H2PO41氮源、无机盐 KNO31氮源、无机盐 NaNO3 3 氮源、无机盐MgSO47H2O0.50.2 0.50.5无机盐FeSO40.010.010.01无机盐KH2PO44 无机盐K2HPO410.51

53、 无机盐NaCl 5 5 0.5 10无机盐KCl0.5 无机盐CaCl2 0.25 无机盐S 10能源 H2O100010001000100010001000溶剂pH 7.0 自然7.0 灭菌条件12120分11230分12120分12120分12120分12120分*表中培养基各组份含量均为每升培养基中该成份的克数。培养其他化能自养型微生物与上述培养基成分根本类似,只是能源物质有所改变。对光能自养型微生物而言,除需要各类营养物质外,还需光照提供能源。培养异养型微生物需要在培养基中添加有机物,而且不同类型异养型微生物的营养要求差异很大,因此其培养基组成也相差很远。例如,培养大肠杆菌的培养基组

54、成比拟简单(表4-10),而有些异养型微生物的培养基的成份非常复杂,如肠膜明串珠菌需要生长因子,假设配制培养它的合成培养基时,需要在培养基中添加的生长因子多达33种,因此通常采用天然有机物来为它提供生长所需的生长因子。就微生物主要类型而言,有细菌、放线菌、酵母菌、霉菌、原生动物、藻类及病毒之分,培养它们所需的培养基各不一样。在实验室中常用牛肉膏蛋白胨培养基或简称普通肉汤培养基培养细菌(表4-10);用高氏1号合成培养基培养放线菌(表4-10);培养酵母菌一般用麦芽汁培养基,它是将麦芽粉与4倍水混匀,在5865条件下保温34小时至完全糖化,调整糖液浓度为10巴林, 煮沸后用纱布过滤,调pH为6.

55、0配制而成。麦芽粉组成复杂,能为酵母菌提供足够的营养物质;培养霉菌则一般用查氏合成培养基(表4-10)。原生动物也可用培养基培养,有的原生动物需要较多的营养物质,例如梨型四膜虫(Tetrahymena pyriformis)的培养基含有10种氨基酸、7种维生素、鸟嘌呤、尿嘧啶及一些无机盐等,而有些变形虫可在较简单的蛋白胨肉汤(peptone broth)中生长。大多数藻类可以利用光能,只需要CO2、水和一些无机盐就可生长,而*些藻类如眼虫藻(Euglena)中的一些种可在黑暗条件下利用有机物质生长。有些藻类需要在培养基中补加土壤浸液,培养海洋藻类时可直接利用海水,但如果在特殊情况下需要用合成培

56、养基培养海洋藻类时,则必需在培养基中参加海水中含有的各种盐。2.营养物质浓度及配比适宜培养基中营养物质浓度适宜时微生物才能生长良好,营养物质浓度过低时不能满足微生物正常生长所需,浓度过高时则可能对微生物生长起抑制作用,例如高浓度糖类物质、无机盐、重金属离子等不仅不能维持和促进微生物的生长,反而起到抑制或杀菌作用。另外，培养基中各营养物质之间的浓度配比也直接影响微生物的生长繁殖和(或)代产物的形成和积累,其中碳氮比(C/N)的影响较大。严格地讲，碳氮比指培养基中碳元素与氮元素的摩尔数比值,有时也指培养基中复原糖与粗蛋白之比。例如，在利用微生物发酵生产谷氨酸的过程中,培养基碳氮比为4/1时,菌体大

57、量繁殖,谷氨酸积累少;当培养基碳氮比为3/1时,菌体繁殖受到抑制,谷氨酸产量则大量增加。再如,在抗生素发酵生产过程中,可以通过控制培养基中速效氮(或碳)源与迟效氮(或碳)源之间的比例来控制菌体生长与抗生素的合成。3.控制pH条件培养基的pH必须控制在一定的围,以满足不同类型微生物的生长繁殖或产生代产物。各类微生物生长繁殖或产生代产物的最适pH条件各不一样,一般来讲,细菌与放线菌适于在pH77.5围生长,酵母菌和霉菌通常在pH4.56围生长。值得注意的是,在微生物生长繁殖和代过程中,由于营养物质被分解利用和代产物的形成与积累,会导致培养基pH发生变化,假设不对培养基pH条件进展控制,往往导致微生

58、物生长速度或(和)代产物产量降低。因此,为了维持培养基pH的相对恒定,通常在培养基中参加pH缓冲剂,常用的缓冲剂是一氢和二氢磷酸盐(如K2HPO4和KH2PO4)组成的混合物。K2HPO4溶液呈碱性,KH2PO4溶液呈酸性,两种物质的等克分子混合溶液的pH值为6.8。当培养基中酸性物质积累导致H+浓度增加时, H+与弱碱性盐结合形成弱酸性化合物,培养基pH不会过度降低;如果培养基中OH-浓度增加, OH-则与弱酸性盐结合形成弱碱性化合物,培养基pH也不会过度升高。但K2HPO4/KH2PO4缓冲系统只能在一定的pH围pH6.47.2起调节作用。有些微生物，如乳酸菌能大量产酸,上述缓冲系统就难以

59、起到缓冲作用,此时可在培养基中添加难溶的碳酸盐(如CaCO3)来进展调节,CaCO3难溶于水,不会使培养基pH过度升高,但它可以不断中和微生物产生的酸,同时释放出CO2,将培养基pH控制在一定围。在培养基中还存在一些天然的缓冲系统,如氨基酸、肽、蛋白质都属于两性电解质,也可起到缓冲剂的作用。4. 控制氧化复原电位(redo* potential)不同类型微生物生长对氧化复原电位()的要求不一样,一般好氧性微生物在值为+0.1伏以上时可正常生长,一般以+0.3+0.4伏为宜,厌氧性微生物只能在值低于+0.1伏条件下生长,兼性厌氧微生物在值为+0.1伏以上时进展好氧呼吸,在+0.1伏以下时进展发酵

60、。值与氧分压和pH有关,也受*些微生物代产物的影响。在pH相对稳定的条件下,可通过增加通气量(如振荡培养、搅拌)提高培养基的氧分压,或参加氧化剂,从而增加值;在培养基中参加抗坏血酸、硫化氢、半胱氨酸、谷胱甘肽、二硫糖醇等复原性物质可降低值。5. 原料来源的选择在配制培养基时应尽量利用廉价且易于获得的原料作为培养基成份,特别是在发酵工业中,培养基用量很大,利用低本钱的原料更表达出其经济价值。例如，在微生物单细胞蛋白的工业生产过程中,常常利用糖蜜(制糖工业中含有蔗糖的废液)、乳清(乳制品工业中含有乳糖的废液)、豆制品工业废液及黑废液(造纸工业中含有戊糖和己糖的亚硫酸纸浆)等都可作为培养基的原料。再