熊胆冻干粉针剂对缺氧

1、熊胆冻干粉针剂对缺氧【关键词】熊胆；,血管内皮；,丙二醛；,一氧化氮摘要：目的讨论熊胆冻干粉针剂对缺氧-再复氧损伤的血管内皮细胞的保护作用及抗动脉粥样硬化机制。方法采用脐静脉血管内皮细胞huanubilialvEinendthelialell，HUVE体外原代培养方法。通过倒置相差显微镜观察和比拟，各组内皮细胞形态，用TT法检测吸光度值，利用比色法测定细胞上清夜中的丙二醛alndialdehyde，DA和一氧化氮nitrixide，N含量。结果TT法结果显示：正常组、熊胆组与缺氧再复氧组比拟有显著差异P0.01。缺氧-再复氧组的DA含量增高，而N含量降低，正常组和熊胆组中检测结果相反。结论熊胆

2、冻干粉针剂对缺氧再复氧损伤的血管内皮细胞有保护作用。关键词：熊胆；血管内皮；丙二醛；一氧化氮PrtetiveEffetsftheLyphiledPderInjetinfBearBilenVasularEndthelialellsInduedbyHypxia-rexygenatinInjuryAbstrat：bjetiveTstudytheprtetiveeffetsfthelyphiledpderinjetinfbearbilenulturedvasularepithelialells(VE)induedbyhypxia-rexygenatininjury,andstudytheehaniss

3、fanti-atherslersis.ethdsByusingpriaryulturefhuanubilialvEInendthelialells(HUVE)invitr,theVEseredividedintthreegrups.TherphlgialhangesfVEbytheinvertedirspe,theptialdensity(D)valuefellseredetetedbyTTlrietriethd,ntentfDAandNinthesupernatantfluidfulturedellseredetetedbyspetrphtetry.ResultsTheTTassayshed

4、thatDvaluehadsignifiantdifferene(P0.01)beteennralgrup,bearbilegrupandhypxia-rexygenatingrup.TheDAntentinreasedandNntentdereasedinthehypxia-rexygenatingrup,inntrast,DAntentdereasedandNntentinreasedinthenralandbearbilegrups.nlusinTheresultsindiatethatthelyphiledpderinjetinfbearbilehasprtetiveeffetsfrt

5、heHUVEinjuryinduedbyhypxiarexygenatininjury.Keyrds：Bearbile;Vasularepithelialell;alndiadehyde;Nitrixide缺血-再灌注是再灌注心肌损伤、缺血性脑卒中等严重疾病中常见的过程。缺血缺氧极易导致血管内皮细胞(vasularendthelialell，VE)的死亡和严重功能紊乱，从而进一步加重组织损伤。目前关于缺血-再灌注时细胞损伤的机制及对其的保护的研究主要集中在神经细胞和心肌细胞，对VE的研究极少。本实验通过用连二亚硫酸钠造成缺氧再复氧模型后用熊胆，观察其抗缺氧作用及其机制。1材料与方法1.1材料1

6、.1.1人脐静脉内皮细胞人脐静脉内皮细胞huanubilialveinendthelialell，HUVE，以酶消化法获得。1.1.2试剂与主要仪器熊胆冻干粉针剂由延边大学药学院提供。人第八因子相关抗原因子是美国Santaruz产品，一氧化氮N和丙二醛DA检测试剂盒购置于南京建成生物。199培养基为美国GIB公司产品；胎牛血清为美国HYLNE公司产品；连二亚硫酸钠为沈阳市东兴试剂；TT为SIGA公司产品。倒置相差显微镜，日本LYPUS产品，37度2培养箱是德国SL产品。1.2方法1.2.1脐静脉内皮细胞的别离及培养按Jaffe等1，2的方法略加修改进展。在无菌条件下，取安康产妇分娩后6h以内的

7、脐带，灌注0.1%型胶原酶llagenase1015l，置37水浴中孵育1520in。搜集含有细胞的酶液，放入离心管中,1000r/in离心10in,沉淀中参加含有20FBS，50U/l肝素、终浓度为2g/l的L谷氨酰胺的完全199培养液5l，充分混合制成细胞悬液，以1.52.0104/2密度植入培养瓶中，置37，5的2培养箱中培养，待细胞长成交融状态后进展鉴定。1.2.2分组及药物处理实验随机分为3个组：分别为缺氧-再复氧组，正常组和熊胆组。熊胆组的熊胆终浓度分别为60，80，120g/l和160g/l。细胞缺氧再复氧损伤造模法：根据文献3略加修改，采用氧去除剂连二亚硫酸钠造成缺氧，种板培养

8、24h后，各孔弃去培养基，用无糖Earls液洗细胞2次，正常对照孔参加199培养基；模型孔参加含连二亚硫酸钠终浓度为1.0l/L的无糖Earls液，缺氧4h后参加完全199继续培养12h，造成细胞缺氧再复氧损伤模型。熊胆组参加含连二亚硫酸钠终浓度为1.0l/L的无糖Earls液，缺氧4h后参加终浓度分别为60，80，120，160g/l的熊胆，37孵育12h。1.2.3TT法检测内皮细胞存活率取对数生长期的细胞制备细胞混悬液，接种于96孔培养板内，细胞浓度为15105/l，每组设8个平行孔，细胞处理同上。细胞置52培养箱孵育24h，待细胞贴壁及根本长满时开场做试验。吸弃个孔液体，参加无血清19

9、9培养基100l，再参加5g/lTT工作液20l，混匀，37孵育4h。翻板法弃去孔内培养液，每孔加DS二甲基亚砜100l，用微量振荡器摇震10in，使充分溶解。在酶标仪490n处测量各孔D值，以不加细胞孔调零，酶标仪自动打印结果。1.2.4形态学观察倒置相差显微镜下直接观察内皮细胞生长情况。1.2.5DA，N测定选用生长良好的HUVE，制成细胞悬液，以浓度1105/l接种于24孔培养板。先用含20的FBS的199培养基，培养24h后换用无血清199培养基，实验方法同上，然后搜集各孔上清液，按照北京邦定生物技术提供的试剂盒说明，用分光光度计法检测DA，N含量。1.2.6统计学处理所有实验数据均以

10、s表示，应用Exel软件进展t检验。转贴于论文联盟.ll.2结果2.1内皮细胞形态学观察在倒置相差显微镜下观察，正常组E生长旺盛，呈上皮样贴壁生长，细胞呈多角形或长梭形，呈鹅卵石样铺满底层。缺氧-再复氧组E缺氧2h后，细胞间隙增大，胞体变小，细胞收缩变圆，胞浆透明，少数细胞悬浮脱落；随着作用时间进一步延长，胞膜边缘不清楚，局部胞膜不完好，细胞出现空泡和颗粒变性，细胞脱落增多，到将近4h的时候出现拉网现象，而熊胆组的E形态与正常组根本相似。结果见图13。论文联盟.LL.编辑。图1正常组细胞10略图2缺氧再复氧组细胞10略图3熊胆组细胞10略2.2各组细胞培养液中D值、DA、N含量的检测结果结果见

11、表1。正常组、熊胆组与缺氧再复氧组比拟，D值均有显著差异P0.01。缺氧-再复氧组的DA含量增高，而N含量降低；相反，正常组和熊胆组中DA含量减少，而N含量增高；缺氧再复氧组与正常组、丹参组比拟具有显著性差异P0.01。表1各组内皮细胞中D值、DA含量及N含量的比拟略正常组、熊胆组与缺氧再复氧组比拟，*P0.013讨论心血管疾病是人类死亡的首要原因。其中动脉粥样硬化是引起各种心血管疾病的主要原因。研究说明4体内许多因素可损伤VE，以活性氧最重要。活性氧可氧化修饰低密度脂蛋白，生成氧化低密度脂蛋白xidizedldensitylipprtEin,XLDL，进而促进动脉粥样硬化的开展。缺氧再复氧后

12、产生的活性氧可以引发脂质过氧化而导致损伤，引起内皮细胞的功能紊乱，造成血管壁的通透性增加，因此，血浆脂蛋白和脂蛋白渗入内皮下间隙，脂蛋白进入这一间隙后被氧化成为XLDL，引起动脉粥样硬化5。熊胆作为传统的名贵中药，具有清热、平肝、镇痉止痛、明目去翳、健胃利胆、杀虫等作用。熊胆粉中胆酸类主要成分是去氧胆酸、牛磺去氧胆酸和牛磺鹅去氧胆酸钠。牛磺去氧胆酸是熊胆粉特有的主要成分，含量达25686。TT比色法7是大多数药物敏感性实验中所采用的简便，快速的方法之一。结果说明药物浓度在60160g/l范围内对缺氧损伤的E具有保护作用。N是内皮细胞释放的血管舒张因子，对动脉粥样硬化有防治作用。N是VE损伤的一

13、个敏感的标志物8。在人体内N是通过N合成酶NitrixideSynthase，NS由L-精氨酸氧化产生。NS有3种，其中eNS主要表达于内皮细胞，是N合成的主要限速因素。实验中发现用缺氧再复氧组的内皮细胞N含量明显减少，说明E功能受损。用熊胆干预后的HUVE，与缺氧组比拟N含量升高。缺氧组内皮细胞经缺氧处理4h后N含量有所减少，这可能与脂质过氧化物抑制eNS活性和直接灭活N有关。研究说明9脂质过氧化的内皮细胞eNS蛋白表达降低，而内皮细胞内一氧化氮合成酶主要为eNS，另外超氧阴离子与N作用，还生成其它的一些硝基化合物，使N减少10。因此脂质过氧化的内皮细胞中的一氧化氮含量降低。而给药组一氧化氮

14、含量减少的不明显的原因可能为熊胆作为抗氧化剂减少氧自由基的生成，减少超氧阴离子对N的破坏；熊胆可能直接激活NS，从而进步N含量。Quillen等11用缺氧条件下培养的HUVE实验发现，缺氧可直接作用于E，使其合成释放N减少，本研究结果与之相符。缺血缺氧的氧自由基增加，2与N生成N3，导致N代谢加快，N含量减少。总之，熊胆通过减轻内皮细胞缺氧再复氧损伤及减少脂质过氧化物，减轻细胞的氧化损伤，平衡内皮细胞分泌的N含量来到达防止内皮细胞进一步损伤及动脉粥样硬化进一步开展的目的。参考文献：1JaffeEA,takaharaT,YaaguhiN,etal.alturefhuanendthelialell

15、sderivedfrubilialvEInsindentifiatinbyrphdgiandiunlgyriteriaJ.JlinInvest,1973,52:27452钱勇，张励.内皮细胞生长因子和肝素对人脐静脉内皮细胞增殖的影响J.眼科研究.2022，211：26.3闫彦芳，张壮.三七总皂苷及其主要成分对血管内皮细胞缺氧损伤的保护作用J.中国实验方剂学杂志，2002,8(1);34.4任德成.血管内皮细胞的氧化性损伤机理J.心血管病学进展，2002，234235.5夏敏.氧化应激与动脉粥样硬化J.国外医学内科学分册，2001，28(8):323.6张启明，段晓建，严克东，等.高效液相色谱法直接测定熊胆粉中牛磺熊去氧胆酸和牛黄鹅去氧胆酸的含量J.药物分析杂志，1993，135：321.7丘仑兴.用TT改进法检测肿瘤细胞化疗药物敏感性J.江西医学院学报，1997，3720：21.8阎西艴，张福兴.血管内皮功能不全及其防治J.岭南心血管病杂志，2001，71：48.9张泉三，董国雄，张杜华，等.维生素对脂质过氧化损伤人脐静脉内皮细胞的保护作用J.中国动脉硬化杂志，2002，