链霉素发酵工艺验证方案

1、链霉素发酵工艺验证方案目的：确认链霉素发酵系统工艺流程，确认种子工艺、小小罐工艺、小罐工艺、中罐工艺、大罐发酵工艺，验证该发酵系统工艺的稳定性和牢靠性及制备 的发酵液能否到达中间体规格要求。范围：50验证地点：403验证对象：原斜面代 、代 斜面12母瓶子瓶小小罐小罐中罐大罐验证步骤：确定验证方案，确定验证打算，内容、步骤，以便准确验证链霉素发酵系统。验证措施概要：生产记录：原斜面：冷藏期10外观无菌外观集落:白色饱满、正常代 或代1142外观无菌外观集落：白色饱满、正常母瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝681700u/ml963500u/ml 6700u/ml冷藏期5菌

2、丝IIIII子瓶：无菌斜面及外观无菌菌丝粘稠、色泽米黄、无颗粒状菌丝120小时7000u/ml144 小时7500u/ml冷藏期7 天 菌丝IIIII小小罐：菌丝IIIII镜检无菌PH7.5小罐：菌丝IIIII镜检无菌1200u/m3.5g/100m PH7.5中罐：菌丝IIIII镜检无菌1800u/m3.5g/100m PH7.5大罐：放罐残糖2.0 克/100毫升放罐残氮120毫克/100毫升放罐透光度40%放罐效价14000u/ml原材料：生产过程中所用的各种原材料及其规格见原材料一览表设备：生产链霉素所及设备见设备一览表。以上所及设备的每一局部，必需在本次验证前确保经过适当鉴定IQ/O

3、，并且任何相关的测试装置经过校正。人员培训，作为验证争辩的一局部，涉及生产链霉素发酵的每位职工均经GMP及有关岗位SOP培训。生产程序和流程表：生产过程的描述：我厂用于生物合成链霉素的生产菌种为灰色链霉菌，为了保持菌种的24冰库内，或者将孢子制成牛奶悬浊液，密闭冷藏于196液氮中。每年对生产菌株进展两次自然分别，把握菌落变异率5%，并进展菌丝八代遗传稳定性考察，考察其母、子代谢及效价单位的稳定性。挖取清洁海滩细沙不能污染各种有机物100 吸尽砂内铁屑备用，挖取郊区地面二尺深处的黄土不能污染各种有机物120 目筛子过筛,用磁铁充分吸尽土内铁屑备用。以上处理的砂和土，按土一份，砂二份比例混合，分装

4、于玻璃试管12100m，每支装1g，用纱布棉塞塞紧置于小铜线筐中，放消毒锅消毒，间歇灭菌三次，每次压力0.12MP122111 120、45 小时，外说明批号、日期备用，使用前为确保无菌起见，应按以上要求再消毒烘干一次。取符合质量要求的孢子斜面一支，在无菌操作下,参加 0.85%氯化1ml 1#棒将外表孢子轻轻刮下防止用力过重划破琼脂1ml 割头无菌吸管吸出，准确认真地在每支无菌空白砂土管内加 0.1ml 孢子液参加时应留意将吸管伸至接近沙土处，但又不能接触沙土，也不能使吸管口接触沙土管口及内壁。塞紧棉塞，将沙土敲松摊开，放在真空枯燥器内枯燥器内放置氯化钙枯燥剂0.10MPa4 4 5 支或以

5、上时，抽干时间酌情增加，取出抽干的沙土孢子，敲松放在盛有无水24冰库中保存备用。使用时承受2 年。市售颖牛奶离心三次，3000rpm,15分钟弃去上层脂肪,将脱脂牛 分钟消毒。121，60 分钟，间隙灭菌三次，待用。2#棒轻轻将孢子刮下，用无菌吸管吸孢子牛奶悬浊液置灭菌珠子瓶，10 分钟,1ml 无菌吸管将珠子瓶内的孢子牛奶悬浊液参加无菌安培管中，0.3ml/5年。100 级，每三个月对尘埃粒子0.5u 的尘埃3.5 /1L空气、风速0.35m/、无菌定点开启双碟分钟1 个/碟进展测定。寻常每次操作定点放置定点开启双碟30 分钟，把握杂菌菌落1 个/碟。每天用前紫外光消毒一小时，每三个月调换消

6、毒剂1/600洁尔灭、75%酒精。孢子斜面：取生产用之孢子沙土管或孢子冷冻管在无菌室内，用操作棒勺取适量27167 天，该生长成之孢子斜面称为原斜面，仅作孢子传代使用，不能制备母瓶，液氮冷冻孢子接出原斜面。依据质量2410 天。斜面外观除了个别不正常集落以外，应大部份为白色，饱满梅花型， 馒头型、圆型之集落，将原斜面孢子，选择23 只正常集落点种第一代，用第一代传代斜面同样点种其次代传代斜面，第一其次代孢子斜27l67 天，第一、其次代斜面14 天，均可制作母瓶，孢子斜面传到其次代为止，不再传第三代，挖块制作过母瓶之剩余孢子斜面，应保存在冷藏库中一个月，以备检用。斜面培育基配制法：名称配比 %

7、葡萄糖注射用0.81.2蛋白胨0.30.6氯化钠0.40.6豌豆浸出液1216琼脂海燕牌2.02.8pH7.07.4C (g/100ml)C (g/100ml)N (mg/100ml)P (ug/ml)pH0.9-1.232-3860-906.8-7.5豌豆浸出液制备：豌 豆： 30 克氯 仿： 0.5%二次1000ml1M H SO ：调pH用2430 克豌豆洗净沥干，参加1000ml1M H SO pH至244.50.5盖紧放置于 371MH2SO4 调整PH 值维持在 4.24.50.5%371 6 天，粗滤20 去除氯仿750ml 摇瓶中，每瓶装量约200ml0.09Mpa、11812

8、020分钟，冷却后放入冰箱中备用。同时抽样送化验，检验质量，在使用该批豌豆浸出液时，必需再送一次样品，测定氨氮含量与第一次相接近时可按后一次样含量计算使用，如其次次含量与第一次不符，须再抽样复试，以最终一次化验数据为准进展计算使用。豌豆浸出液质量：工程工程外观氨氮NH -N24无菌状况磷(PO )规格澄清液170200mg/100ml600ug/100ml左右无杂菌4.1.4母瓶：用符合质量标准的同支孢子斜面冷藏期不超过14 天在无菌室内用挖块法分别将孢子接种到已预备好之二只摇瓶中，编号为母I 母 II， 接种后送至温度 27l23020r mm摇瓶机上，5064II 一IIII 用牛皮纸包扎

9、存放于24II 连续培育作质量检查，做无菌试验二支，分别进展2737培育。68 PH、uml24 小时取一次样测定上述工程，共计三次68 小时， 96 小时，120小时三次如母瓶质量符合要求，则母瓶可以进罐使用，5 天。制得的母瓶应菌丝稠粘，目检无菌丝团颗粒、米黄色、无异味不化稀无菌正常。效价：120 小时6700uml。接子瓶的母瓶制备法，用无菌操作挖一块斜面，接入一只母瓶，在摇瓶5064 颗粒状菌丝的母瓶，作为接子瓶用，接种子瓶的母瓶不冷藏。遇特别5天。母瓶原材料及配比方下：原材料葡萄糖配比%3.55.5黄豆饼粉碳酸钙硫酸铵3.04.50.50.80.50.8氯化钠磷酸二氢钾0.250.5

10、0.040.07消后质量规格：CC(g/ml)N(mg/100ml)P(ug/100ml)3.84.8130155130155子瓶：取符合种子质量标准之母瓶，在无菌操作条件下，用吸管接入已预备吸管做无菌试验斜面一支，在37恒温室培育，接种后子瓶送 27l3044 IIIII 初，长好后，留120 144 小时分别取样测定效价，一瓶测粘度及氨氮，一瓶接无菌斜面二支作无菌试验分别培育于273恒温室及观看菌丝形态菌株要加测C及P247 天，如在保存期间觉察有化稀现象或有染菌嫌疑，即停顿使用，改用其他批号种子，放摇23 批瓶存备用。制得的子瓶应菌丝稠粘，目检无菌丝团颗粒，米黄色，无异味。不化 子瓶原材

11、料及配比方下：原材料配比%葡萄糖3.55.5黄豆饼粉2.33.5碳酸钙0.20.7硫酸铵0.50.7氯化钠00.2磷酸二氢钾0.0450.07豆油1L玉米浆00.2消后质量规格：N(mg/100ml)160180P(ug/100ml)155180C(g/ml)C(g/ml)6.04.8在某罐种子移植到下一级罐后，进展罐内的冲洗及阀垫的更换检查严密度，检查局部包括空气分布管，搅拌轴封，与罐相连之法兰焊接及15 分钟并检查过滤器有无培育基倒流。培育基实行实消：0.160.19MPa 进展投料实消。先加水至搅拌处，然后投入已配好的培育基，搅拌成匀浆0.070.12MPa 时20 115124，完毕后

12、保压冷却待接种，取消后样测定C、N、P、PH。28 0.1m3小时流0.5m323 只小罐作种子用。接4 8 PH C 和效价，25 8 NII III 初阶2 小时须将种液涂片镜检什菌状况，培育条件：271，35030rmin，4668h，0.5m3/分，假设种子罐生长过程中pH 量，调整配方等工艺调整措施，以期使各级种子罐质量符合种子质量要求。小小罐原材料及配比方下：原材料名称葡萄糖 黄豆饼粉硫酸铵 碳酸钙小小罐120L配比3.55.52.53.50.50.70.20.7小小罐(500L)配比磷酸二氢钾玉米浆0.0450.070.10.2(机动)豆油1L/罐批氯化钠配料体积100L0.10

13、.2250L消后体积100L250L消后规格如下小小罐小小罐pH6.08.0C2.84.4N115170P120200小小罐把握规格：消后CNP 必需符合质量要求，假设不符合则重投料、消毒。中间把握温度必需在271，超过30时间较长则不能作为种子。染菌罐不能作种子用。氨氮在中间代谢中必需渐渐利用，假设后期上升则不作种子用。5放罐把握：残糖3.5g/100ml，残氮140mg/100ml，PH7.5，效价800uml。IIIII 初为主。2 3 瓶以上。小罐：在某罐种子移植到下一级罐后，进展罐内的冲洗及阀垫的更换，检查严密度，检查局部包括空气分布管，搅拌轴封，与罐相连之法兰焊接15 分钟并检查过

14、滤器有无培育基倒流。培育基实行连消：经清洗，检查严密后的罐批方可进展空消，空消时0.160.19MPa 时，排出罐内冷凝水后再开头计算4045 1251300.080.1MPa 时导入无菌空气保压，即可进入连消状态。连消时总蒸汽压力不低于 0.25MPa，按生产进度把各类罐空消完毕， 0.20.25MPa，45 分钟后可进入连消连消时通过泵把培育基输入消毒维持罐0.2MPa，126135、56吨h。消入罐中，冷却培育基至近培育温度，保压待接种，取消后样测C、N、P、PH。0.160.19MPa 压力跌 0MPa 进展投料实消。则先加水至搅拌处，然后投入已配好的培育基，搅拌成匀浆状加热。翻开各支

15、路蒸汽，关闭罐盖待压力上升0.070.12MPa2025分钟，消毒温度为115124，完毕后保压冷却待接种，取消后样测定C、N、P、PH。0.2m3分，5 lm3分，一只小罐种子通常移入一只中罐，特别状况时一只小罐种子可移入二只中罐。4 8 PH C 和效价，25 8 小时测N，种子罐移种标准菌丝呈IIIII 初阶2 小时须将种液涂片镜检什菌状况，培育条件：271，33020rmin，4060h，1m3/分。假设种子罐生长过程中遇代谢过快时可适时降温培育，遇代谢慢种子罐PH 上升，可削减通气量，小罐原材料及配比方下：原材料名称原材料名称小罐(500L)配比葡萄糖4.55.5黄豆饼粉2.53.5

16、硫酸铵0.50.7碳酸钙0.20.7磷酸二氢钾0.050.07玉米浆0.10.2(机动)豆油1L/罐批氯化钠0.10.2配料体积250L消后体积250L消后质量规格如下：小 罐小 罐pH6.08.0C3.55.5N120180P130190小罐把握规格：消后P必需符合质量要求，假设不符合指差距较大接种前必需订正。271。染菌罐不能作种子用。4放罐把握：残糖3.5g/100ml，残氮140mg/100ml，PH7.5，效价1200uml。IIIII 4048 小时。中间代谢中，氨氮必需逐步利用。2 只小罐。一只小小罐可全部接入中罐作种子用。中罐：在某罐种子移植到下一级罐后，进展罐内的冲洗及阀垫的

17、更换，检查严密度，检查局部包括空气分布管，搅拌轴封，与罐相连之法兰焊接及阀门等，如15 分钟并检查过滤器有无培育基倒流。0.160.19MPa 时，排出罐内冷凝水后再开头计算4045 125130罐压维持在 0.080.1MPa 时导入无菌空气保压，即可进入连消状态。连消时总蒸汽压力不低于 0.25MPa， 按生产进度把各类罐空消完毕，同时各所用管路也必需经蒸汽消毒，压力 0.20.25MPa，45 分钟后可进入连消，连消时通过泵把培育基输入消毒维持罐，连消条件为0.2MPa，126135、56 吨h。消入罐中，冷却培育基至近培育温度，保压待接种，取消后样测C、N、P、PH。中罐由小罐移入种子

18、或整只小小罐移入，开头加空气流量，前5 小360m3h，每二只中罐可移入一只大罐。各级罐压出种子前均先用被接种罐内培育基压到压出罐接种管进展冷却管道，防止烫伤种子。4 8 PH C 和效价，25 8 小时测N，种子罐移种标准菌丝呈IIIII 初阶2 小时须将种子液涂片镜检什菌状况。培育条件：271，18020rmin，3560h，6 m3/分，假设种子罐生PH 削减通气量，调整配方等工艺调整措施，以期使各级种子罐质量符合种子质量要求。原材料葡萄糖原材料葡萄糖 黄豆饼粉硫酸铵 氯化钠 碳酸钙 玉米浆 豆油硫酸二氢钾配料体积消后体积配比%4.55.52.53.50.50.70.102(机动)0.2

19、0.70.10.2(机动)8L/罐0.050.073.23.5M3.03.2M消后质量规格如下：PHPH消 后 C消后N消后 P6.08.0(g/100ml)3.55.5(mg/100ml)120180(r/l)130190中罐把握规格：CNP 必需符合质量要求，假设不符合指差距较大在接种前必需实行措施订正。中间把握温度必需在271，超过30时间较长则不能作为种子用。染菌罐不能作种子用。氨氮在中间代谢中必需渐渐利用。菌龄必需以把握菌丝阶段IIIII 3050 小时。接种量一只小罐接一只中罐，或一只小小罐可接一只中罐。7放罐把握：残糖3.5g/100ml，残氮140mg/100ml，PH7.5，

20、效价1800uml。8小小罐、小罐、中罐遇到氨氮消耗快时可将罐温调整到26 0. 5培育。大罐：大罐放罐后，降罐压至零磅，开盖用水冲洗，将冲洗后的残留发酵液，压入提炼承接桶内，再翻开罐盖，进罐内去除积垢后，检查搅拌，空 气分布管，叶子及上下婆司是否松，同时进展阀垫及填料的更换和检 修工作。然后盖好罐盖，通入空气，进展各连接处法兰等、阀门、配 根、罐盖、氨水、空气等严密度检查。待检查完毕后，盖紧罐盖、准 备下次空罐消毒。如遇染菌，可下去敲铲，去除积垢，空消时延长消 30 分钟。罐空消：0.160.19MPa 进展压水后进展45 0.080.1MPa 保压，假设上一罐批染菌，则金属过滤器进展消毒。

21、发酵罐培育基消毒：0.3MPa，用泵将已配制的氮源饼粉等碳源糖水依次分别进入消毒塔、维持罐消0.2MPa58分钟。 2 吨自来水，最终可酌情消入自来水补足体积。发酵罐原材料及配比方下：原材料原材料黄豆饼粉葡萄糖硫酸铵配比1.82.24.06.00.20.7氯化钠碳酸钙 磷酸二氢钾豆油 玉米浆 氯化钴 配料体积消后体积00.20.20.70.060.091030L0.10.20.23440M2537M消后质量规格如下：pHC(g/100ml)大于6.24.56.5消后 N (mg/100ml)130160消后 P(r/ml) 2002603040M378分钟后，004006MPa，开启入罐阀接入

22、培育基，当培育基遇到蛇形管、即开冷却水冷却。当接料完毕，关闭入罐阀，进空气，保持罐压 008009MPa，待温度冷至29预备接种。消后测PH要求 62 以上，如低则加NaOH 调整。接种前、接种后取样测C、N、P、PH并做无菌测验。发酵罐大罐接种和培育，发酵工艺。发酵罐接种：01MPa 以上，保持发酵罐之0.030.05MPa，翻开接种入罐阀，种子罐中罐或倒动身酵罐菌液借压力差流入发酵大罐内，接完后关罐入罐阀，开入适量空气流量在 10m3分以上，保持罐压先将罐内培育基压到压出种子罐接种管道进展管道冷却，防止烫伤种子。发酵罐培育和工艺接种：发酵大罐由2348110hr35t。各级罐压出种子前均先

23、用被接种罐罐内培育基压到接种罐进展冷却管道，防止烫伤种子。IIIII2液涂片镜检什菌状况.培育条件罐温:2630，一般把握在29，罐温测定用电阻温度计量来2527培育，后期代谢慢的罐批30培育数小时至放罐。罐压:。空气流量:10m分以上，不开搅拌，以后逐级增加流2530m/4555。如遇发酵后期反响剧烈，可适当降低空气流量和提高罐压。搅拌转速:大罐正常转速在 110120rmin，亦可依据生长代谢进展调速。前期70时，搅拌全开，中后期搅拌全开。培育时间:16010中间取样:8214pH，2010081002440814000uml，透光度40%。发酵大罐中间把握消沫：前期或后期发酵猛烈时可少量

24、屡次加油，中期由于补糖量增加液面上升也可酌情加油，假设加油无效可放提炼假设干吨。补糖：30504060，203046反常罐可酌情减量补入。第一次把握残糖含量缺乏部份添加至4.85.2%其次次把握残糖含量4.85.0%第三次把握残糖含量4.04.5%第四次把握残糖含量2.52.8%第五次把握残糖含量1.72.0%特别状况一次补糖量3.0时以分二次补入为宜，第三、四、五次补0.5则第五次糖可以不补。后期把握补糖量应与氮耗相调，防止发酵液化稀。补氮：补氮可用15的无菌过滤氨水或NHSO4241依据残氮用量计算通氨量参考控氮水平。3参考代谢及浓度。204035l35l次通氨为流加，生长期最适pH6.56.9，氨氮水平可在90120mg100m40PH把握在6.87.，80100mg100mlpH7.10NHSO424替氨水，以调低 pH SO0.l20mg100ml NHN。硫4242酸氨把握补入量0.11401207585mg10